＊史嫣然 高妍 尉桦聪 刘静逸 刘定坤 高云

（辽宁科技大学 化学工程学院 辽宁 114051）

引言

近年来由于许多生物化学过程都涉及分子识别，因此能够用于识别阳离子和阴离子的荧光分子探针的研究已经引起了广泛的关注[1]。作为生物体中必需的微量元素，Cu2+存在于各种生物酶中，如细胞色素氧化酶和氨基氧化酶等[2]。Cu2+浓度过低会引起代谢紊乱，甚至导致疾病或死亡，心脑血管疾病也与人体缺乏Cu2+密切相关。然而，Cu2+浓度过高也会引起许多疾病包括阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症和帕金森病[3]。因此Cu2+的检测对人类健康具有重要意义。硫化氢（H2S）是一种具有臭鸡蛋臭味的有毒气体[4]。在食品样品中，这种气体含有机硫的食品，如鸡蛋、肉类、蔬菜、水果等自然产生的。H2S是通过调节生理代谢和提高抗氧化酶活性来延长蔬菜和水果的贮藏时间[5]。虽然H2S有利于食品的储存，但它对一些饮料和食品有不利影响[6]。因此，对H2S的检测可以作为衡量食品新鲜度的重要指标。在本研究中，以三苯胺作为荧光团，引入咪唑作为识别基团，设计合成了一种通过“开-关-开”的方式接力识别Cu2+和H2S的新型荧光分子探针。

图1 探针SYR接力识别Cu2+及S2-的传感机制

1.实验部分

(1)荧光探针SYR的合成

图2 探针SYR的合成路线

探针SYR的合成：将按照已报道方法[7]合成的4-[4-(二苯基氨基)苯基]-2-羟基苯-1-甲醛（0.365g，1mmol）、双（2-吡啶基）甲酮（0.184mg，1mmol）和乙酸铵（0.231g，3mmol）溶解在15mL乙酸溶液中，加热回流6h，反应结束后，将反应混合物倒入到冰水混合物中，然后用40% NaOH溶液调节pH至中性并用二氯甲烷进行萃取，有机相用无水硫酸钠进行干燥，旋干，用硅胶色谱柱进行纯化得黄绿色目标产物SYR，产率为78%。通过探针SYR的1H NMR(DMSO-d6,400MHz)和13C NMR(DMSO-d6,101MHz)，计算得出探针SYR的相对分子质量为：531.2185，根据实验发现探针SYR的相对分子质量为：531.2177。

2.结果与讨论

(1)荧光探针SYR对Cu2+的紫外光谱响应

如图3（a）所示，在DMF缓冲溶液中，探针在358nm处有一强的吸收峰，随着Cu2+浓度的增加，358nm的吸收峰强度逐渐减弱，并且波长发生一定程度的红移，当加入的Cu2+达到1.4μL后，吸收光谱基本不再变化，在292nm和379nm出现两个等吸收点。图3（a）中插图为探针识别铜离子的颜色响应，不加Cu2+时探针呈现蓝色荧光，加入Cu2+后，探针溶液呈现淡蓝色。如图3（b）所示，加入等当量的如Zn2+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+等其他金属离子后，探针的紫外光谱几乎没有改变，只有加入Cu2+后探针的紫外吸收强度明显降低且波长红移。上述实验结果表明探针对Cu2+具有良好的专一识别能力。

图3 （a）探针对Cu2+的紫外滴定光谱；（b）探针对Cu2+的紫外筛选光谱；（c）探针对Cu2+的荧光滴定光谱；（d）探针对Cu2+的荧光筛选光谱;（e）探针对Cu2+的线性方程；（f）探针对Cu2+浓度的线性方程

(2)荧光探针SYR对Cu2+的荧光光谱响应

图3（c）为荧光分子探针在DMF缓冲溶液中对Cu2+的荧光滴定谱图，由实验结果可知，随着Cu2+的浓度逐渐增大，探针的荧光强度不断降低，当加入的Cu2+达到1.4μL时，有机小分子探针强度降到最低，荧光淬灭率为70.0%。同时，只有加入Cu2+后探针的荧光强度明显降低（图3（d）），表明探针SYR对Cu2+具有良好的专一识别能力。

依据荧光分子探针荧光强度随Cu2+浓度的变化曲线，根据线性方程，按照探针与金属离子2:1的配位模式进行线性拟合（如图3（e））。可计算出探针SYR识别Cu2+的络合常数为3.46×105M-2。

COPD是一种以气流受阻为特征慢性疾病，主要临床表现有咳嗽、气短、咳痰、呼吸困难等。COPD虽属于气道疾病，但可致全身性反应[3]。肺康复治疗是COPD防治的主要措施之一，但在我国，康复治疗应用较晚，目前尚缺乏规范化治疗手段，且患者的治疗依从性较差[4]。

为进一步研究探针识别Cu2+的灵敏度，根据探针荧光强度随Cu2+浓度的变化规律绘制工作曲线（图3（f）），实验结果表明Cu2+在0～6μM范围内，分子探针的荧光强度与Cu2+的浓度呈良好的线性关系，线性方程为Y=197903X+290283，根据直线的斜率可拟合计算出探针识别Cu2+的最低检测限为1.92nM。

(3)荧光探针SYR-Cu2+对S2-的紫外光谱响应

考虑到S2-与Cu2+之间存在较强的亲和力，采用紫外吸收光谱考察了SYR-Cu2+对S2-的识别性能如图4（a）。随着S2-（0～20μM）浓度的不断增加，探针在390nm处的吸收强度逐渐降低，在355nm处的吸收强度逐渐增大，当加入的S2-达到15μM后，吸收光谱基本不再变化，且与探针的紫外光谱基本一致，这主要是由于S2-与Cu2+配位后将配体重新释放出来，从而使得体系的紫外光谱恢复到与探针的基本一致。而加入其它阴离子如Br-、Cl-、F-、HSO4-、HCO3-、NO2-、Cys的加入对SYR-Cu2+的紫外光谱几乎没有影响，如图4（b）。结果证明SYR-Cu2+对S2-具有较强的选择性识别作用。

图4 （a）探针SYR-Cu2+对S2-的紫外滴定光谱；（b）探针SYR-Cu2+对S2-的紫外筛选光谱；（c）探针SYR-Cu2+对S2-的荧光滴定光谱；（d）探针SYR-Cu2+对S2-的荧光筛选光谱

(4)荧光探针SYR-Cu2+对S2-的荧光光谱响应

为了进一步研究S2-的接力识别，采用荧光滴定法研究了SYR-Cu2+对S2-的鉴定。如图4（c）所示。随着S2-（0～20μM）的逐渐加入，SYR-Cu2+(10μM）的荧光强度逐渐增大，最后与分子探针SYR的荧光光谱基本一致。表明SYR-Cu2+可作为灵敏的化学传感器来检测S2-。另外，只有加入S2-后探针SYR-Cu2+的荧光强度明显升高如图4（d），利用线性拟合计算可求出SYR-Cu2+识别S2-的最低检测限为2.57×10-8M。表明探针SYRCu2+对S2-具有灵敏的专一识别能力。

(5)荧光探针SYR对Cu2+的传感机制研究

利用HR-MS研究了SYR对Cu2+的识别机制。如图5所示，HR-MS分析表明[SYR+H+]+在m/z=531.2177处有一个分子离子峰。加入Cu2+后，m/z=1122.8404处的峰归属于[2SYR-2H++Cu2++H+]+，证实了SYR-Cu2+是按2:1的化学计量比配位而成的。

图5 探针SYR识别Cu2+前后的HR-MS

3.结论

本文设计合成了一种以三苯胺作为荧光团，咪唑作为识别基团的新型荧光分子探针SYR。该探针能够高灵敏的专一识别Cu2+，Cu2+的引入可使探针的荧光大幅淬灭，其识别机理为分子内电子转移（PET）机理。探针SYR与Cu2+的络合模式为按2:1。当Cu2+在0～6μM的浓度范围内SYR探针的荧光强度和Cu2+浓度呈良好的线性关系，经拟合计算，络合常数和检测限分别为3.46×105M-2和1.92nM。生成的SYR-Cu2+对S2-表现出明显的荧光增强反应。探针SYR-Cu2+识别S2-的最低检测限为2.57×10-8M。该荧光传感器可后续应用于实际水样中Cu2+的检测。本研究丰富了Cu2+和S2-的检测手段，在生物传感、环境监测等领域有着良好的应用前景。