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改进QuEChERS-液质联用法测定黄精中23种农药残留

2024-02-27何华军张辉夏丽敏王远远

浙江农业科学 2024年2期
关键词:黄精硅胶净化

何华军,张辉,夏丽敏,王远远

(1.景宁畲族自治县食品药品检验检测中心,浙江 丽水 323500;2.景宁畲族自治县生态林业发展中心,浙江 丽水 323500;3.浙江省食品药品检验研究院,浙江 杭州 310051)

黄精,习称鸡头参、老虎姜、九蒸姜、野山姜、千年运等,为百合科黄精属的多年生草本植物,以根茎入药,是我国传统的“药食同源”滋补中药材之一,具有悠久的药用历史和确切的临床疗效[1]。浙江省作为黄精主产区之一,拥有优越的林业生态资源,尤其是林下自然环境[2]。近几年黄精的人工种植规模不断扩大,种植过程中也出现了各种病虫害问题,并有愈发严重的趋势[3]。在黄精种植过程中化肥农药不规范、超量使用现象仍然较多,存在较大的环境污染和农药残留风险[4-5]。因此,《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则农药残留量测定法(2341)[6]新增了第五法“药材及饮片(植物类)中禁用农药多残留测定法”,进一步规范和限制中药材种植过程的农药使用,推动中医药市场健康发展。

液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)作为农药多残留检测方法之一,适用于分析受热易分解、分子量较大、不适用于气相色谱分析的农药[7-8],该检测方法灵敏度高,定性定量检测可以同时进行,检测结果准确。QuEChERS方法作为一种操作快速、高效、简单的样品萃取与基质净化技术,最初由美国农业部Anastassiades等[9]开发,该方法因其简单和高通量而被广泛接受,而且大多数农药的回收率较高[10]。但中药材的基质复杂、杂质多、干扰多,传统的QuEChERS方法并不能适用于各种不同基质的药材,因此,需要针对部分药材基质对该方法进行优化,以获得最佳的检测条件[11-13]。

本文以丽水市黄精种植企业生产的黄精为研究对象,以《中华人民共和国药典》 (2020年版)四部通则为指导,利用改进QuEChERS方法对黄精样品进行提取净化,采用UPLC-MS/MS法同时对23种农药残留进行了测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters Xevo TQS 三重四级杆串联质谱仪:美国Waters公司;ST-16R 高速冷冻离心机:赛默飞世尔科技(中国)有限公司;XH-B 漩涡混合器:江苏天翎仪器有限公司;PP020XXM1 超纯水器:英国ELGA公司;GM 200刀式研磨仪:弗尔德(上海)仪器设备有限公司;ME 104电子天平:梅特勒-托利多仪器有限公司。

23种农药标准品(浓度为1 000 mg·L-1):氧乐果、多菌灵、噻虫嗪、吡虫啉、乐果、啶虫脒、嘧霉胺、烯酰吗啉、腈菌唑、嘧菌酯、氟环唑、联苯肼酯、马拉硫磷、三唑磷、咪鲜胺、倍硫磷、二嗪农、辛硫磷、茚虫威、丙溴磷、增效醚、毒死蜱、哒螨灵,均由坛墨质检科技股份有限公司提供。

乙腈(色谱级):德国默克公司;甲酸(色谱级)、QuEChERS提取盐包(6 g无水硫酸镁,1.5 g无水乙酸钠):赛默飞世尔科技(中国)有限公司;乙酸铵(分析纯):上海展云化工有限公司;冰醋酸(分析纯):江苏强盛功能化学股份有限公司;无水硫酸镁(MgSO4,分析纯):南京化学试剂股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA,40~63 μm)、十八烷基硅烷键合硅胶(C18,40~63 μm)、石墨化碳黑(GCB,120~400目)、硅胶(48~74 μm):天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 标准溶液的配制

取23种标准农药物质各1.0 mL分别加入到10 mL容量瓶中,用乙腈定容至10 mL,配制成质量浓度均为100 μg·mL-1的标准储备液,-18 ℃避光冷藏保存。取空白黄精基质,梯度稀释至不同质量浓度(0.5、1、5、10、20、50 ng·mL-1)的溶液,即得。

1.3 检测条件

1.3.1 色谱条件

色谱柱:Waters HSS T3 C18(1.8 μm,2.1 mm×100 mm);柱温:40 ℃;流速:0.45 mL·min-1;流动相A:乙腈-0.1%甲酸溶液;流动相B:0.1%甲酸溶液(含5 mmol·L-1甲酸铵);洗脱:0~0.25 min,2%A;0.25~7.75 min,2%~99%A;7.75~8.5 min,2%A;8.50~10.00 min,2%A。

1.3.2 质谱条件

以Waters Xevo TQS LC-MS-MS联用仪检测,电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI);正离子扫描模式;多反应监测(multi reaction monitoring,MRM);毛细管电压:3.0 kV;脱溶剂(氮气)流速:1 000 L·h-1;温度:450 ℃。

1.4 试验方法

1.4.1 供试品溶液的制备

取供试品粉末(过孔径0.25 mm筛)3 g,置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中,加入1%冰醋酸溶液15 mL,涡旋使药粉充分浸润,静置30 min,精密加入乙腈15 mL,涡旋混匀,置恒温振荡器中振荡5 min,加入QuEChERS提取盐包,立即摇散,再置恒温振荡器于5 ℃下振荡5 min,离心(5 ℃,5 000 r·min-1)5 min,取上清液9 mL于预先装有C18(300 mg)、PSA(300 mg)、硅胶(100 mg)的15 mL净化管中,涡旋混匀,置恒温振荡器振荡5 min,离心(5 000 r·min-1)5 min,取上清液过0.22 μm滤膜,即得。

1.4.2 空白基质液的制备

取空白基质样品,同供试品溶液的制备方法(1.4.1节)处理成空白基质溶液。

2 结果与分析

2.1 LC-MS/MS条件的选择

用适宜浓度的标准溶液,通过LC-MS/MS 的Intellistart调谐程序,优化锥孔电压和碰撞能量,选择相对丰度较高、出峰稳定的离子碎片,获得了23种农药最优质谱检测参数,如表1所示。23种农药目标物的总离子流图如图1所示。

图1 23种农药MRM总离子流图Fig.1 MRM total ion flow diagram of 23 pesticides

表1 23种农药的质谱参数及液相保留时间Table 1 Mass spectrometry parameters and liquid phase retention time of 23 pesticides

2.2 QuEChERS法的优化

2.2.1 GCB对23种农药吸附的影响

GCB作为常用的QuEChERS净化吸附剂有去除色素的作用,如类胡萝卜素和叶绿素,但它们二者对含苯官能团的化合物有较强吸附作用,会降低其回收率[14]。因此,本试验对空白黄精样品进行加标,比较其加标回收率,加标量为50 μg·kg-1,在含有900 mg无水硫酸镁、300 mg PSA、300 mg C18、300 mg硅胶净化条件下分别考察了不同GCB使用量下(0、30、60和90 mg)23种农药回收率的影响,结果见图2。如图2所示,多菌灵、嘧霉胺、联苯肼酯、咪鲜胺、毒死蜱的回收率随着GCB用量的增加明显下降,可能与其较强的吸附作用有关。当GCB用量为0时,剩余农药的回收率相比其他3组差别不大,因此,本试验不使用GCB作为净化材料。

图2 不同GCB使用量下23种农药回收率Fig.2 Recovery rates of 23 pesticides under different GCB usage levels

2.2.2 硅胶对23种农药吸附的影响

由于在单独使用PSA或者C18作为净化剂时,乐果、马拉硫磷、辛硫磷、咪鲜胺等多种农药的回收率明显受到净化条件的影响,不符合检测要求,为进一步探寻成本更低,更加绿色的检测方法,本试验在含有900 mg无水硫酸镁、300 mgPSA、300 mgC18净化条件下分别考察了不同硅胶使用量下(0、100、200和300 mg)23种农药回收率的影响,结果见图3。如图3所示,当硅胶使用量为0时,辛硫磷回收率较低,其他3组各农药回收率相差较小,且都能满足检测要求,考虑到试验成本,选择硅胶用量100 mg为最佳条件。

图3 不同硅胶使用量下23种农药回收率Fig.3 Recovery rates of 23 pesticides under different silicone usage levels

综上所述,当无水硫酸镁(900 mg)、PSA(300 mg)、C18(300 mg)、硅胶(100 mg)组合作为净化剂时,23种农药的回收率在77.49%~107.11%,满足农残检测的要求,检测成本也更低。因此,本实验选择该组合作为净化剂。

2.3 基质效应

基质效应是由于不同化合物在LC-MS/MS分析中对电喷雾界面的电离效率会有不同的影响,这种影响表现为离子增强或抑制,容易导致检测结果有不同程度的误差。本试验的基质效应(ME)根据公式“ME等于基质匹配标准曲线的斜率除以溶剂标准曲线的斜率减去1再乘以100%”进行评估,当ME>0时,表现为基质增强效应;当ME<0时,为基质抑制效应。此外,若|ME|≤20%,表示弱基质效应;若|ME|在20%~50%,则表示中等基质效应;若|ME|>50%,表示强基质效应[15-16]。结果见表2,在黄精基质中嘧霉胺具有强基质效应,吡虫啉和联苯肼酯具有中等基质效应,其余农药具有弱基质效应。本试验采用黄精基质匹配标准溶液绘制的标准校正曲线对黄精中23种农药定量,降低基质效应的影响,提高检测结果准确性。

表2 23种农药的线性方程、 相关系数、 基质效应、 检出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,matrix effects,detection limits,and quantification limits of 23 pesticides

2.4 方法学验证

本试验采用基质匹配外标法定量,将一定量的混合标准工作溶液用空白基质液梯度稀释成6个浓度的标准工作溶液,根据色谱条件测定混合标准工作溶液,绘制23种农药的基质匹配标准曲线。以信噪比S/N=3时确定检测限(LOD),以信噪比S/N=10时确定定量限(LOQ)。

23种农药的线性范围、相关系数、定量限、检出限见表2。

23种农药化合物的标准曲线浓度范围为0.5~50.0 ng·mL-1,线性相关系数(R2)均大于0.995 5,23种农药化合物的LOQs和LODs分别为0.04~3.29 μg·kg-1和0.01~0.99 μg·kg-1,检出限均低于《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则农药残留量测定法(2341)第五法,可以满足检测要求。

在黄精空白基质中加入低(10 μg·kg-1)、中(25 μg·kg-1)、高(100 μg·kg-1)3个不同浓度水平的混合标准品,按照1.4.1节进行样品前处理,测定回收率,计算相对标准偏差(RSDs),结果见表3。3个不同浓度水平下的加标回收率分别为83.36%~114.52%、75.61%~101.38%、82.29%~103.15%,RSDs 分别为1.26%~9.99%、0.61%~7.08%、0.64%~4.43%,方法回收率和精密度均满足农药残留检测要求。

表3 黄精基质中23种农药的加标回收率及相对标准偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 23 pesticides in Polygonatum sibiricum matrix

3 结论与讨论

本文通过对净化条件、质谱条件等优化,确定黄精中23种农药多残留的 QuEChERS前处理方法,方法学考察结果显示,23种农药的 LOD为0.01~0.99 μg·kg-1,LOQ为 0.04~3.29 μg·kg-1,标准曲线R2在0.995 5~0.999 9,加标回收率在75.61%~114.52%,RSD在0.61%~9.99%。本文所建立的检测方法操作简便、高效灵敏、准确可靠,可为黄精中相关农药的残留监测提供技术支撑。

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