高呼日叉,郭无瑕,陈 红,刘梦宇,李晓旭,赵志英

(1.包头医学院,内蒙古包头 014040;2.巴彦淖尔市医院;3.包头医学院人体解剖学教研室)

缺血性脑卒中是卒中的一种典型表现形式,是影响我国患病率和死亡率的重要因素之一[1-2]。缺血性脑卒中是指因为脑部血液供应缺失而导致的脑缺血、低氧性坏死,以及相关的神经系统功能损害所引发的一种现代临床综合征[1]。临床上对脑缺血处理方法主要是恢复血液,但在有些情形下会加剧损害,称为脑缺血/再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)[2]。尽管对脑缺血级联反应已取得巨大的进展,但减少脑缺血和I/R损伤的有效保护神经疗法仍未实现。

蒙医学是指蒙古族人民拥有一整套系统和科学理论体系的少数民族医学,是我国传统医学的一个部分。现代蒙医学中,突发性脑血管疾病统称为“萨病”,属于白脉(白脉指神经)疾病范畴,是因气血瘀滞导致黑脉(黑脉指血管)堵塞,继而引起“白脉之海”,使大脑失去功能而致病,临床中蒙药用于治疗缺血性脑卒中有一定的历史且在预防和治疗方面有独到之处[3]。蒙药新黑苏嘎乌日勒是根据《蒙医金贵》经典组方黑苏嘎-25味丸制成的治疗缺血性脑卒中的有效方剂[4],由18单味药组成,即石决明、红花、诃子、豆蔻、肉豆蔻、丁香、檀香、人工麝香、荜茇、木香、肉桂、黑种草子、川楝子、栀子、螃蟹、地锦草、海金沙、土木香,具有改善气血运行,调节白脉功能,促进微循环作用,主要治疗脑血管病、动脉硬化、风湿性关节炎等。新黑苏嘎乌日勒在临床CIRI治疗中具有良好的治疗效果[4],目前也已通过动物实验验证了其效果,但其作用机制尚不完善,还需要进一步全面和系统地研究。

网络药理学是一项通过计算机辅助算法设计和构建的虚拟模式分析药物与疾病靶点相互之间“多成分、多靶位、多路径”协同效应关系的新技术,适用于复杂中成药方剂新靶点的发现。蒙药同中药治疗复方剂一样具多组分及多成分的特性[5]。本研究利用网络药理学方式,探讨蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗CIRI的主要作用机制。

1 材料与方法

1.1蒙药新黑苏嘎乌日勒相关靶点预测 利用TCMSP数据库(http://tcmspw.com)为主,筛选大部分单味中药的生物活性成分,ADME设定口服生物利用率(OB)≥30%、血脑屏障(BBB)≥-0.3、类药性(DL)≥0.18为主要筛选标准,进一步通过TCMSP预测靶点蛋白。未满足TCMSP数据库的单味药物通过TCMID数据库(http://www.megabionet.org/tcmid/)、ETCM数据库(http://www.tcmip.cn)、BATMAN数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn)以及知网文献搜索分别查找,利用PubChem数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下载以上搜索到的化合物sfd格式的2D结构图后,以SwissADME同样考虑口服生物利用率、类药性、血脑屏障筛选条件,运用SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)收集符合条件的有效成分并进行靶点蛋白预测,并获取Probability等于1或者前10的数值。其中螃蟹成分与脑缺血再灌注研究甚少,因此现暂不考虑纳入此研究。最后,在Uniprot数据库(https://www.Uniprot.org/)中实现基因标准化和去重汇总。

1.2CIRI疾病相关靶点筛选 从GeneCards数据库系统(https://www.GeneCards.org/)和OMIM数据库系统(http://www.OMIM.org/)中输入“Cerebral ischemia reperfusion injury”检查相关靶点,将两种数据库数值结合后删除重复得到靶点蛋白。

1.3蒙药新黑苏嘎乌日勒治疗CIRI疾病潜在作用靶点的获取 将药物和疾病的靶点分别录入Venny 2.1.0软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/)在线作图平台上得到潜在作用靶点图。

1.4蛋白质相互作用(PPI)网络构建及分析 将经上述方法筛选得到的靶点基因,输入STRING数据库中(https://STRING-dborg/),将最低作用阈值设定为“highest confidence≥0.9”,从而得到蛋白相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)信息。将得到的参数上传至Cytoscape 3.7.2软件进行拓扑分析,选择节点连接度(Degree值)高的核心靶点进行分析。

1.5GO分析及KEGG通路富集分析 利用David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对潜在靶点蛋白通过基因本体(GeneOntology,GO)功能分析及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路加以研究,筛选条件为“Homo sapiens”,用微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn)实现信息可视化管理。

1.6“活性成分-关键靶点-重要通路”网络构建及拓扑分析 为进一步阐释药效成分、关键靶点、重要通路间的关系,利用Cytoscape 3.7.2软件绘制可视化关系图并进行进一步深入分析。

1.7分子对接 分别在PDB数据库系统(http://www.rcsb.org/)和PubChem数据库系统中下载靶点“pdb”格式及成分“sdf”格式结构。使用PyMol 2.4.0软件对大分子进行分离配体、去水等方法,运用Openbable 2.4.1软件进行小分子格式转换,进一步将活性成分和靶点蛋白导入Autodock 4.2.6软件进行对接。最后,再次通过PyMol 2.4.0软件实现分子对接可视化管理。

2 结果

2.1蒙药新黑苏嘎乌日勒相关靶点获取 通过检索TCMSP、TCMID、ETCM数据库以及知网文献检索[6-9]共筛选出108个有效化合物(表1)和278个成分靶点。

表1 蒙药新黑苏嘎乌日勒活性成分

2.2CIRI相关靶点筛选 将从GeneCards和OMIM数据库中获取的靶点数据,经过对基因名Uniprot ID的标准化,并通过整理和删除数据后共得到了1 406个。

2.3基因集韦恩(Venny)图的建立 将药物靶点与疾病靶点,均导入VENNY 2.1.0平台中,获得132个共有交集,即蒙药新黑苏嘎乌日勒为治疗CIRI的潜在关键靶点(图1)。

图1 “疾病-药物”交集靶点韦恩图

2.4PPI网络构建分析及获取关键靶点基因 将蒙药新黑苏嘎乌日勒作用于CIRI的共有靶点导入STRING数据库,根据本研究设定条件得到PPI网络。运用Cystoscape 3.7.2导入节点信息,根据Degree筛选排序,将分值高于2倍平均Degree的基因作为关键靶点展示(图2)。

图2 药物疾病靶点PPI网络

2.5GO和KEGG富集分析结果 通过DAVID数据库的研究结果,以P<0.05为条件共收集到595个生物过程(BP)、108个分子功能(CC)、70个细胞组分(MF)及其119条KEGG通路,将GO功能富集(图3)排名前15生物过程、前10分子功能和细胞组分及前20的KEGG通路(图4)绘图从数据库导出。BP主要涉及缺氧反应(response to hypoxia)、ERK1和ERK2级联的正调节(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、凋亡过程的正/负调控(positive/negative regulation of apoptotic process)、炎症反应(inflammatory response)等;细胞组成(CC)主要涉及质膜(plasma membrane)、胞质(cytosol)、膜筏(membrane raft)、小窝(caveola)、细胞外间隙(extracellular space)等;分子功能(MF)主要涉及酶结合(enzyme binding)、药物结合(drug binding)、蛋白质结合(protein binding)、转录因子结合(transcription factor binding)、蛋白激酶结合(protein kinase binding)等。CIRI相关主要涉及通路为细胞凋亡(apoptosis)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、缺氧诱导因子-1信号通路(HIF-1signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)等。

图3 共同靶点GO分析点线图

图4 共同靶点KEGG分析气泡图

2.6“活性成分-关键靶点-重要通路”网络展示 按照结果2.4中研究PPI中前30关键靶点以及结果2.5中筛选到5条重要通路,据此绘出“活性成分-关键靶点-重要通路”的网络图(图5),其中类正方形节点代表核心靶位,六边节点代表活性成分,类三角形节点则代表关键通路。通过拓扑分析计算度值(Degree)并提取Degree值≥3的活性成分作为重要活性成分,从高到低依次分别为β-胡萝卜素(beta-carotene)、黄芩素(baicalein)、胡椒碱(piperine)、金合欢素(acacetin)、玫瑰树碱(ellipticine)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、伞菌素(corymbosin)、脱氢二异丁香酚(dehydrodiisoeugenol)、芝麻素(sesamin)、异愈创木酚(Isoguaiacin)。同样方法得到Degree值≥5的关键靶点,见表2。

表2 关键靶点(Degree值≥5)

图5 “活性成分-关键靶点-重要通路”多维网络关系图

2.7分子对接结果 符合结果2.4 PPI网络中前9的关键靶点,与结果2.6“活性成分-关键靶点-重要通路”网络中前9关键靶点取交集,获得靶点蛋白ESR1、RELA、AKT1、TP53作为核心靶点。反向与2.6“活性成分-关键靶点-重要通路”网络中前4个重要活性成分进行结合能力预测。结果表明关键靶点与药效成分β-胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素发生较好的结合效应,见表3,将黄芩素与4个靶点蛋白分子对接图展示见图6。

表3 关键靶点与活性成分分子对接结果

图6 黄芩素与靶点蛋白ESR1(A)、RELA(B)、

3 讨论

运用网络药理学筛选出蒙药新黑苏嘎乌日勒有效成分共计108个,作用靶点278个,其中与CIRI共有靶点132个,同时构建“活性成分-关键靶点-重要通路”网络,分析结果表明其核心成分有β-胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素等。β-胡萝卜素作为抗氧化剂,通过减轻内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)脱偶联和硝化应激损伤可以治疗CIRI[10]。黄芩素是黄芩中含量最多的黄酮类物质之一,对预防与治疗缺血性脑卒中具有积极作用,具体表现在减少神经炎症、抑制细胞凋亡和自噬等方面[11]。胡椒碱是一种生物碱,可通过线粒体损伤的调节抗缺血性脑损伤[12]。金合欢素是一种具有抗氧化和抗炎特性的黄酮类化合物,研究提示金合欢素抑制小胶质细胞的炎症反应和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)信号通路,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用[13]。

联合PPI网络和“活性成分-关键靶点-重要通路”多维网络分析,筛选出ESR1、RELA、AKT1和TP53可能是本研究的关键基因。TP53是一类抑癌蛋白转录因子,涉及细胞周期调控、细胞存活衰老、DNA修复和细胞凋亡等[14]。卒中后,TP53在缺血脑组织中迅速积聚,通过转录依赖和非依赖凋亡程序激活神经元凋亡[15]。AKT1是一种蛋白激酶,在PI3K-AKT通路中起着关键蛋白的作用[16]。PI3K-AKT通路广泛参与细胞活动,涉及细胞存活、增殖、代谢和肿瘤进展等,是典型的抗凋亡信号通路[17]。CIRI中,通过激活PI3K-AKT通路刺激下游凋亡蛋白使细胞凋亡,AKT还能够通过活化NF-κB信号通道刺激炎症反应,从而启动多种生存途径[18]。ESR1是雌激素受体α蛋白,黄芪异黄酮通过激活雌激素受体-PI3K-Akt信号通路协同减轻脑缺血再灌注损伤[19]。RELA(NF-κB的一个亚基)是中间转录因子,在炎症反应、免疫和细胞存活中发挥关键作用[20]。先前研究发现,NF-κB通过神经炎症、氧化应激等机制参与脑缺血再灌注损伤[21]。

KEGG通路分析结果显示,蒙药新黑苏嘎乌日勒通过多条信号通路作用治疗CIRI,其中细胞凋亡、肿瘤坏死因子信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路和雌激素信号通路相关研究较多。细胞凋亡是细胞生物体中常见的细胞死亡模式,在缺血后的卒中神经元中可以观察到胞质凝聚、核膜破裂和凋亡小体形成等凋亡的特征[22]。TNF-α是一类能够引发炎症反应的细胞因子,当缺血性脑卒中时,它激活白细胞的组织因子和黏附分子,促进白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、一氧化氮(nitric oxide,NO)和凝血因子Ⅷ的释放,介导微血管功能障碍,加重脑组织的炎症反应。HIF-1在缺血环境中稳定表达,并且在人体几乎全部的神经细胞中都能检测到,其中HIF-1α可高效控制神经细胞凋亡,从而增加神经元细胞在轻度缺血条件下的存活率,对脑组织产生保护效果[23]。关于GO功能富集方面,将重点聚焦于凋亡过程的正/负调控、炎症反应、缺氧反应、血管生成等方面,上述生物学过程体现在复方药物活性成分调节对应靶点和具体通路过程中。结合能力越小,配体与受体蛋白两者发生相互作用的亲和力就越大,因此通常认为结合能力值≤-1.2kcal/mol的分子与靶点具有很好的结合功能[24]。分子对接结果表明,蒙药新黑苏嘎乌日勒的主要活性成分β-胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素与核心靶点ESR1、RELA、AKT1、TP53有较好的结合活性,进一步验证了这些活性成分治疗脑缺血再灌注损伤的可能性。

综上所述,蒙药新黑苏嘎乌日勒主要通过β-胡萝卜素、黄芩素、胡椒碱、金合欢素等有效成分作用于ESR1、RELA、TP53、AKT1等靶点,调节细胞凋亡、TNF-α、HIF-1、PI3K-AKT、雌激素等信号通路,参与细胞凋亡的正负调控、炎症反应、血管生成、缺氧反应等生物过程,从而达到治疗脑缺血再灌注损伤的作用。本研究为临床治疗提供了依据,也为探讨新的治疗方法奠定了思路。