郑文涛,杨 林,王 浩

(1.大理大学第一附属医院神经内科,云南 大理 671000;2.昆明医科大学基础医学院,昆明 650500)

血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)是介于脑组织和血液之间的一种天然屏障[1]。BBB通过选择性地在脑实质和血液之间转移物质,在保护脑组织中起着关键作用。BBB的完整性被破坏是中枢神经病变的重要病理机制之一[2]。例如:脑组织缺血后可以诱发炎症反应,释放的炎症因子可以增加BBB通透性,而BBB通透性的增加又可以加剧血液中白细胞在脑组织的浸润,进一步加重炎症反应。有文献报道,抑制氧化应激和炎症反应可能是保护BBB完整性和治疗相关神经疾病的潜在靶点[3]。褪黑素(MT)是一种在松果体中合成和释放的神经激素,其在改善睡眠障碍、情绪障碍以及增强学习和记忆等方面有着积极作用[4]。

MT通过释放到血液和脑脊液中而发挥重要的生理生化功能[5]。例如,MT可以抗氧化应激、抗炎症,还可以作为免疫调节分子,在机体免疫调节中发挥重要作用[6]。MT及其代谢产物也能作为清除剂,清除各种自由基。有研究结果显示,在大脑发生缺血损害时,MT可以通过激活褪黑素受体(MTs)发挥神经保护作用,MT通过与不同的MTs结合后激活多个信号传导级联,起到抗氧化、抗炎、抗凋亡及抑制自噬的作用,进而发挥细胞保护的作用[7]。

雷美替胺(Ramelteon)是首个被用于治疗失眠的MT受体激动剂[8]。相比MT,Ramelteon对MTs具有更高的亲和力和选择性,在临床中具有更好的疗效和更高的安全性[9]。本研究探讨了Ramelteon对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脑损伤炎症反应、BBB完整性受损的影响,旨在探讨Ramelteon对BBB的保护作用及其潜在的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为育龄6～8周的健康C57BL/6实验小鼠(SPF级,雄性),共24只,体重20～25 g。实验小鼠由大理大学动物实验管理处所提供[使用编号:SYXK(滇)2018-0002],研究严格遵照中国国家动物福利法规定。

1.2 仪器

PF5000型激光多普勒血流仪(上海然哲仪器设备有限公司);KW-DWY-S型脑立体定位仪(南京卡尔文生物科技有限公司);YP-96A型酶联免疫检测分析仪(山东优云谱光电科技有限公司);NX50型冷冻切片机(美国Thermo Fisher公司);WSB-300型光学显微镜(广州微域光学仪器有限公司);HM-P16型荧光免疫PCR检测仪(山东恒美电子科技有限公司)。

1.3 药品与试剂

Ramelteon(武汉普洛夫生物科技有限公司);LPS(美国Sigma-aldrich公司);伊文思蓝(上海创赛科技有限公司);白细胞介素1β(IL-1β,广州奥瑞达生物科技有限公司);单核细胞趋化蛋白1(MCP-1,泉州市九邦生物科技有限公司);山羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK,上海科澄维生物科技有限公司);磷酸盐缓冲液(PBS,上海博湖生物科技有限公司);小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3内皮细胞,武汉普诺赛生命科技有限公司);人核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体、细胞计数法-8(CCK-8)试剂盒(爱必信上海生物科技有限公司);人紧密连接蛋白1(ZO-1)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(天津肽链生物科技有限公司);IL-1β抗体、MCP-1,均购自上海联迈生物工程有限公司;AMPK抑制剂Compound C(武汉科斯坦生物科技有限公司);荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖(上海源叶生物科技有限公司);Nrf2 ELISA试剂盒(上海化邦生物科技有限公司);醌氧化还原酶1(NQO1)ELISA试剂盒(上海心语生物科技有限公司);丙二醛(MDA)检测试剂盒-硫代巴比妥酸(TBA)法(上海尚宝生物科技有限公司);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司)。

1.4 分组与给药

对照组(0.9%氯化钠溶液)、Ramelteon组、LPS组和LPS+Ramelteon组,每组6只C57BL/6雄性小鼠。其中Ramelteon组和LPS+Ramelteon组小鼠腹腔注射Ramelteon[3 mg/(kg·d)],1日1次,连续注射7 d。对照组小鼠腹腔注射相同剂量的0.9%氯化钠溶液,1日1次,连续注射7 d。在第7日结束的时候,LPS组和LPS+Ramelteon组在Ramelteon注射2 h后,向小鼠腹腔内注射LPS(1 mg/kg),并将老鼠处死,取脑组织以备用。

1.5 小鼠神经功能缺损评分

Ramelteon组、LPS组和LPS+Ramelteon组注射药物24 h后,三组各取6只小鼠进行神经功能评分。(1)木条平衡法(木条1.5 cm宽):0分,小鼠失去平衡能力,从木条上跌落;1分,小鼠紧紧握住木条或用四肢钩住木条>60 s;2分,小鼠在60 s内保持稳定的平衡姿势,但未在木条上移动;3分,小鼠在木条上自由行走,并可以自由转动。(2)鼠尾悬挂法:0分,小鼠肢体下垂,不能弯曲;1分,小鼠前肢在原位挣扎;2分,小鼠前肢可以弯曲,后肢不能;3分,小鼠挣扎后后肢可弯曲;4分,小鼠挣扎后能向尾部弯曲;5分,小鼠在15 s内弯曲到尾部。将2种神经功能评估方法的评分相加,得出神经功能评分,评分越高,神经功能缺损程度越轻。

1.6 伊文思蓝分析

伊文思蓝是一种非膜的渗透性染料,在神经病学领域,可作为示踪剂观察BBB的完整性。正常生理条件下血浆蛋白是无法透过BBB的,由于其与血浆蛋白有很强的亲和力,所以与血浆蛋白结合的伊文思蓝也无法透过BBB,通过观察伊文思蓝泄露可以了解BBB完整性的损伤情况[10]。经Ramelteon治疗后,将伊文思蓝溶液(2 mg,1%溶于0.9%氯化钠溶液)经小鼠尾静脉注射,循环30 min后将小鼠斩首,然后在冰上快速分离脑组织并保存。

1.7 bEnd.3内皮细胞培养

将bEnd.3细胞置于DMEM培养基中生长,并在培养基中添加4.5 g/L葡萄糖、3.7 g/L碳酸氢钠、4 g/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素,所有细胞培养物均在37 ℃和5%CO2/95%室内空气的潮湿培养箱中保存。需要经过药物处理的Ramelteon组和LPS+Ramelteon组,将细胞以1.0×104个/cm2的密度接种于组织培养皿中,分别在Ramelteon药物浓度梯度为30、60 nmol/L的情况下,使用LPS(1 μg/mL)处理细胞。然后,将部分细胞加入六孔板中,培养24 h后,等待细胞快铺满六孔板后,加入1 mmol/L的二甲双胍处理细胞1 d,促进AMPK磷酸化的激活。最后,为了敲除bEnd.3细胞中的Nrf2,用完全不含抗菌药物的培养基继续培养细胞并用LPS和Ramelteon处理,检测Nrf2的含量以评估Nrf2的敲除效率。

1.8 CCK-8细胞活力的测定

使用CCK-8试剂盒评估细胞活力。将20 000个bEnd.3细胞接种在96孔板中,并在LPS和Ramelteon处理之前温育24 h。为了确定存活力,分别于0、24、48、72和96 h后在每个孔位中加入10 μL的CCK-8溶液,在(37 ℃,5%CO2)恒温箱中下培养小鼠,最后使用全自动定量绘图酶标仪在450 nm处测量吸光度。

1.9 BBB通透性的测定

荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖是由荧光素异硫氰酸酯偶联葡聚糖形成的一种标志物,是由不同长度的支链葡萄糖分子组成的被标记的多糖,可根据所使用的葡聚糖的大小来测定BBB的溶质、离子和蛋白质渗透性。将100 μL含有500 μg/mL荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖的溶液涂于细胞单层顶端表面并在PBS中继续培养24 h,然后从细胞基底外侧室取出约20 μL样品,并按1∶5的比例用PBS缓冲液稀释。随后,在490/520 nm处进行荧光光谱法测定。

1.10 其他常规生物学及组织学方法

采用免疫染色和蛋白质印迹法检测脑组织和内皮细胞中ZO-1和闭合蛋白(Occludin)的表达。采用定量反转录聚合酶链反应和酶联免疫吸附试验法检测炎症因子IL-1β和MCP-1水平的表达。用硫代巴比妥酸法检测脑组织和内皮细胞中MDA的浓度。用蛋白质印迹法检测细胞核中Nrf2和NQO1的表达情况。

1.11 统计学方法

2 结果

2.1 Ramelteon对LPS诱导小鼠大脑通透性的影响

采用伊文思蓝法检测BBB的通透性,结果见图1。与对照组的16.1 μg/g相比,LPS组小鼠大脑通透性显著升至36.6 μg/g;而相比于LPS组,LPS+Ramelteon组小鼠大脑通透性显著下降为25.6 μg/g,差异均有统计学意义(P<0.05)。

与对照组比较,***P<0.05;与LPS+Ramelteon组比较,##P<0.05。

2.2 Ramelteon对LPS诱导小鼠神经功能的影响

模型制备后6、12 h,与对照组比较,LPS组小鼠神经功能评分显著降低;与LPS组比较,LPS+Ramelteon组小鼠神经功能评分明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组小鼠神经功能评分比较

2.3 Ramelteon对LPS诱导小鼠ZO-1和Occludin的影响

与对照组相比,Ramelteon组小鼠ZO-1和Occludin蛋白表达水平显著上调,LPS组表达水平显著下调;与LPS组相比,LPS+Ramelteon组小鼠ZO-1和Occludin蛋白表达水平有所升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见图2。

与对照组比较,**P<0.05,***P<0.01;与LPS组比较,^^P<0.05。

2.4 Ramelteon对LPS诱导小鼠血管IL-1β和MCP-1的影响

与对照组相比,LPS组小鼠IL-1β、MCP-1 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+Ramelteon组IL-1β、MCP-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05),差异均有统计学意义,见图3。

A.IL-1β mRNA表达;B.MCP-1 mRNA表达;C.IL-1β蛋白表达;D.MCP-1蛋白表达;与对照组比较,***P<0.05;与LPS组比较,##P<0.05。

A.小鼠脑血管中Nrf2表达;B.小鼠脑血管中NQO1的表达;C.小鼠脑血管中MDA水平;与对照组比较,**P<0.05,^^^P<0.05;与Ramelteon组比较,***P<0.01;与LPS组比较,##P<0.01。

2.5 Ramelteon对LPS诱导小鼠氧化应激的影响

与对照组相比,Ramelteon组小鼠Nrf2和NQO1表达显著上调(P<0.05),而LPS组小鼠Nrf2和NQO1表达显著下调(P<0.05);与Ramelteon组比较,LPS组小鼠Nrf2和NQO1表达显著下调(P<0.05);与LPS组相比,LPS+Ramelteon组小鼠Nrf2和NQO1的表达显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,LPS组小鼠MDA水平升高;与LPS组相比,LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)组小鼠MDA水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见图4。

2.6 Ramelteon对LPS诱导的bEnd.3脑内皮细胞通透性和细胞活力影响

LPS组bEnd.3细胞存活率的仅为67%;LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)组bEnd.3细胞存活率分别达到了85%和96%,相较LPS组差异均有统计学意义(P<0.05);与LPS组相比,LPS+Ramelteon(30 nmol/L、60 nmol/L)组内皮细胞通透性明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05),见图5。

A.细胞活力;B.内皮通透性;与对照组比较,***P<0.01;与LPS组比较,##P<0.05。

2.7 Ramelteon对LPS诱导的bEnd.3脑内皮细胞中ZO-1和Occludin降低的影响

改为LPS组内皮细胞ZO-1和Occludin的mRNA、蛋白水平较对照组显著下降,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS+Ramelteon(30、60 nmol/L)组内皮细胞ZO-1和Occludin的mRNA、蛋白水平较LPS组显著提升,且差异均有统计学意义(P<0.05),见图6。

2.8 Ramelteon对LPS诱导的bEnd.3脑内皮细胞氧化应激影响

LPS组Nrf2和NQO1在bEnd.3脑内皮细胞的表达水平较对照组显著降低(P<0.05);LPS+Ramelteon(30、60 nmol/L)组Nrf2和NQO1在bEnd.3脑内皮细胞中的表达水平较LPS组显著升高,且差异均有统计学意义(P<0.05),见图7。

A.Nrf2蛋白水平;B.内皮细胞通透性;C.ZO-1和Occludin的mRNA水平;与对照组比较,**P<0.05;与LPS组比较,^^P<0.05;与LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组比较,###P<0.05。

A.Nrf2相对蛋白表达量;B.ROS相对生成量;C.细胞活力;与对照组比较,***P<0.01;与LPS组比较,##P<0.05;与LPS+Ramelteon组(60 nmol/L)比较,^^P<0.05。

2.9 Nrf2基因敲除对Ramelteon对bEnd.3内皮细胞的保护作用影响

在转染Nrf2-siRNA细胞中Nrf2的表达显著降低,建立Nrf2基因沉默细胞成功,见图8(A)。与对照组相比,LPS组bEnd.3内皮细胞通透性明显增加(P<0.05);与LPS组比较,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组内皮细胞通透性明显降低(P<0.05);在Nrf2基因敲除后,相比Ramelteon(60 nmol/L)组,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2组内皮细胞通透性明显升高(P<0.05),上述差异均有统计学意义。与对照组相比,LPS组ZO-1和Occludin表达水平明显降低(P<0.05);与LPS组比较,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组ZO-1和Occludin表达水平升高(P<0.05);在Nrf2基因敲除后,相比于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2组ZO-1和Occludin表达水平降低(P<0.05),上述差异均有统计学意义,见图8。

2.10 Ramelteon对LPS诱导的BBB损伤的影响

与对照组比较,LPS组Nrf2相对蛋白表达量降低(P<0.01);与LPS组相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组Nrf2相对蛋白表达量升高(P<0.05);而LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2组、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2组相较于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组Nrf2蛋白表达量降低(P<0.05),上述差异均有统计学意义。与对照组比较,LPS组检测到活性氧(ROS)相对生成量明显升高(P<0.01);与LPS组相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组ROS相对生成量降低(P<0.05);LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2组、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2组相较于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组ROS相对生成量升高(P<0.05),上述差异均有统计学意义。LPS组细胞活力较对照组显著降低(P<0.01);与LPS组相比,LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组细胞活力升高;LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+siNrf2组、LPS+Ramelteon(60 nmol/L)+Compound C+Nrf2组相较于LPS+Ramelteon(60 nmol/L)组细胞活力降低(P<0.05),上述差异均有统计学意义,见图9。

3 讨论

本研究旨在探讨Ramelteon对LPS诱导的体外BBB模型通透性升高的保护作用及其机制。研究结果表明,加入Ramelteon治疗后受LPS影响的小鼠神经功能评分有所提高。同时,本研究观察到Ramelteon改善了LPS诱导小鼠大脑通透性升高,且降低了炎症相关因子IL-1β和MCP-1的表达,提示Ramelteon对LPS诱导的脑血管炎症反应有抑制作用,这表明Ramelteon对BBB的损伤具有一定的保护作用。

BBB的主要功能是维持中枢内环境的稳定,为神经系统信号传导提供一个稳定的离子空间,以确保大脑正常的工作[11]。BBB由内皮细胞及其细胞间的紧密连接、完整的基膜、周细胞、小胶质细胞及星形胶质细胞以及围成的神经胶质膜构成[12]。目前,尚不了解BBB完整性的损伤是否与MT水平下降有关,但有研究报道,MT能够改善LPS诱导的BBB损伤[13],通过阻止LPS引起的Occludin以及claudin-5降解实现。本研究发现,在LPS的刺激下,小鼠大脑和体外bEnd.3内皮细胞的BBB通透性均显著增加,同时伴有ZO-1、Occludin的下调。这些数据表明BBB的完整性受到LPS刺激的损害,通过Ramelteon治疗可显著逆转LPS诱导BBB通透性增加和ZO-1、Occludin表达降低,提示Ramelteon对LPS诱导的BBB损伤具有保护作用。

有文献报道,炎症反应可参与脑损伤的过程[14]。大脑缺血缺氧后会激活炎症细胞,增加炎症因子的表达,如MCP-1、IL-1β等,激活的炎症细胞进入脑组织再次释放更多的炎症因子,形成级联反应从而破坏BBB。本研究观察到,在受到LPS刺激后脑血管炎症因子的释放显著升高,但在经过Ramelteon治疗,明显抑制了LPS诱导的脑血管炎症反应,提示Ramelteon对LPS诱导的脑血管炎症反应具有抑制作用。

氧化应激与中枢神经系统疾病的发病机制相关,当机体ROS成分与抗氧化系统之间的平衡被打破时,氧化应激将会发生一系列的适应性反应[15]。氧化应激主要是由于过量的ROS分泌产生的,当ROS的活性高于抗氧化防御时即可引起氧化应激反应[16]。LPS在激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶后会诱导机体产生过多的ROS,ROS过度积累引起氧化应激,从而导致BBB完整性的损伤[17-19]。因此,ROS的过度积累诱发氧化应激反应与BBB完整性受损诱发的疾病发病机制有关。据相关研究报道,ROS是受Nrf2信号通路调控的[20]。本研究观察到,LPS能引起BBB模型血管内皮中的Nrf2和NQO1表达显著下降,同时MDA产生增加,提示LPS可以激活氧化应激;在加入了Ramelteon后,氧化应激反应被明显抑制。

为了进一步证实Ramelteon在对LPS诱导脑血管的保护作用,我们研究了Ramelteon在体外bEnd.3内皮细胞通透性的作用。Nrf2基因沉默后,Ramelteon失去了对LPS诱导的ZO-1和Occludin减少以及内皮细胞单层通透性增加的保护作用,提示Ramelteon对BBB的保护作用可能是通过激活Nrf2信号通路介导的。

MT除了具有催眠的药理作用,MT还具有一定的抗炎作用[21]。MT及其代谢物能清除各种氧自由基,且能够通过激活AMPK以及抑制gp91 phox蛋白表达,改善LPS诱导的BBB损伤[22]。因此,本研究加入了AMPK的抑制剂Compound C,结果显示,在加入了Compound C后,Nrf2蛋白表达有所下调。与LPS+Ramelteon组相比,加入Compound C后检测到ROS的含量有所增加,细胞活力也显著下调。因此,本研究结果表明,Ramelteon可能通过激活AMPK-Nrf2信号通路改善LPS诱导的BBB通透性升高。