武金强, 谷若萌, 马子安

廊坊市人民医院口腔科,河北廊坊065000

慢性牙周炎是菌斑微生物导致的牙周组织慢性炎症性疾病,持续激活的炎症反应会导致牙周组织发生不可逆破坏,严重时会造成牙齿松动和脱落,其机制目前尚不十分清楚。牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎常见致病菌,局部组织中存在的模式识别受体能识别该病原菌,并通过下游信号通路激活炎症反应、细胞凋亡及焦亡等,进而导致组织损伤和破坏[1-2]。NLRP3是一类模式识别受体,以NLRP3为核心的炎症小体可介导炎症反应和细胞焦亡,牙龈卟啉单胞菌导致的牙周膜细胞损害与激活NLRP3炎症小体有关[3]。为深入认识NLRP3炎症小体在牙龈卟啉单胞菌感染导致慢性牙周炎中的作用,本研究分析慢性牙周炎牙龈卟啉单胞菌感染患者NLRP3炎症小体与炎症反应及焦亡指标的相关性,为临床提供参考。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择本院2020年2月—2022年2月收治的慢性牙周炎患者300例,按照牙龈卟啉单胞菌感染情况分为阳性组194例和阴性组106例。阳性组男101例、女93例,年龄(48.31±7.71)岁;轻度138例,重度56例,病程1～4年;发生全口牙牙槽骨吸收22例,磨牙牙槽骨吸收67例,前牙牙槽骨吸收72例。阴性组男64例、女42例,年龄(48.09±7.45)岁;轻度76例,重度30例,病程1～4年;发生全口牙牙槽骨吸收10例,磨牙牙槽骨吸收31例,前牙牙槽骨吸收40例。两组一般资料比较差异无显著性(P>0.05)。纳入标准:①符合慢性牙周炎诊断标准[4];②均进行牙龈卟啉单胞菌检测[4];③均通过正畸治疗或拔除患牙获得牙龈组织标本;④均留取龈沟液标本。排除标准:①近3个月接受过抗感染治疗、免疫治疗;②糖尿病、自身免疫性疾病;③恶性肿瘤;④妊娠或哺乳者。本研究获得本院医学伦理委员会批准,取得患者或家属知情同意,签署知情同意书。

1.2 牙周健康指标的评估

在治疗前检测两组牙周健康指标菌斑指数(plaque index,PLI)、牙龈指数(gingival index,GI)、附着丧失(atachment loss,AL)、牙周袋深度(pocket depth,PD)。

1.3 荧光定量PCR检测牙周组织NLRP3炎症小体mRNA

提取牙周组织总RNA,将总RNA反转录为cDNA,采用荧光定量检测试剂盒(北京天根生化科技公司)对cDNA中的目标基因NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、Caspase-1进行荧光定量PCR扩增,按照试剂盒说明书操作,以β-actin为内参,计算NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平。

1.4 ELISA检测龈沟液中炎症因子水平

将无菌纸放置在牙周袋底部10 s,取出放入1 mL无菌生理盐水中,室温下洗脱40 min,4 ℃3 000×g离心5 min,收集上清液即为龈沟液。采用酶联免疫吸附测定试剂盒(上海西唐生物科技公司)检测龈沟液中白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平。

1.5 Western blotting检测牙周组织中焦亡标志基因蛋白水平

采用组织裂解液对牙周组织进行匀浆,提取蛋白,Western blotting检测牙周组织中焦亡标志基因GSDMD-N蛋白水平。以β-tubulin为内参计算GSDMD-N蛋白表达水平。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 两组牙周健康指标的比较

阳性组PLI、GI、AL、PD高于阴性组(P<0.05;表1)。

表1 两组牙周健康指标的比较

2.2 两组NLRP3炎症小体mRNA的比较

阳性组牙周组织中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平高于阴性组(P<0.05;表2)。

表2 两组牙周组织中NLRP3炎症小体mRNA的比较

2.3 两组炎症因子水平的比较

阳性组龈沟液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平高于阴性组(P<0.05;表3)。

表3 两组龈沟液中炎症因子水平的比较

2.4 两组GSDMD-N蛋白水平的比较

阳性组牙周组织中焦亡标志基因GSDMD-N蛋白表达水平高于阴性组(P<0.05;图1)。

图1 两组GSDMD-N蛋白水平的比较a为P<0.05,与阴性组比较。

2.5 NLRP3炎症小体与牙周健康指标、炎症因子、焦亡标志基因的相关性

NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表达水平与PLI、GI、AL、PD、IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N蛋白表达水平均呈正相关(P<0.05;表4)。

表4 NLRP3炎症小体与牙周健康指标、炎症因子、焦亡标志基因的相关性

3 讨 论

牙龈卟啉单胞菌是促进慢性牙周炎的致病菌,相关研究证实,牙龈卟啉单胞菌的菌毛、荚膜、膜内成分及其释放的脂多糖、外膜蛋白等参与炎症反应、细胞凋亡及焦亡、氧化应激、内质网应激等生物学环节的调控[5],但具体的生物学机制尚不清楚。

病原菌调控宿主细胞炎症反应、凋亡及焦亡的过程涉及模式识别受体对病原菌成分的识别及细胞内信号转导[6-7]。NLRP3是具有广泛生物学活性的模式识别受体,其与细胞内ASC、Caspase-1共同组成炎症小体,一方面直接参与细胞炎症反应及焦亡的调控,另一方面通过复杂的生物信号转导网络参与氧化应激、内质网应激、凋亡等的调控。慢性牙周炎发病过程中NLRP3炎症小体表达增加已有相关报道[8];另有细胞实验证实牙龈卟啉单胞菌感染能够激活牙周膜细胞中NLRP3炎症小体[4]。本研究证实,合并牙龈卟啉单胞菌感染的慢性牙周炎牙周组织中NLRP3炎症小体的表达高于未感染牙龈卟啉单胞菌的牙周组织,并且NLRP3炎症小体的表达与牙周炎病情指标PLI、GI、AL、PD呈正相关,提示慢性牙周炎发病过程中牙龈卟啉单胞菌感染对NLRP3炎症小体具有激活作用,并且这一激活作用可能造成牙周炎病情加重。

NLRP3炎症小体在识别病原菌的多种成分后通过细胞内ASC招募Caspase-1,后者一方面能够促进IL-1β、IL-18的成熟和释放,进而介导炎症反应激活,增加其他炎症因子如TNF-α释放[9];另一方面能够裂解GSDMD的氨基末端、生成GSDMD并介导细胞焦亡[10]。在慢性牙周炎的多种模型中均存在炎症反应和细胞焦亡的过度激活[11-12]。本研究证实,合并牙龈卟啉单胞菌感染的慢性牙周炎龈沟液中IL-1β、IL-18、TNF-α水平及牙周组织中GSDMD-N水平高于未感染牙龈卟啉单胞菌的牙周组织,提示牙龈卟啉单胞菌感染加重了慢性牙周炎的炎症反应和细胞焦亡。本研究进一步通过相关性分析证实,NLRP3炎症小体表达与IL-1β、IL-18、TNF-α、GSDMD-N水平呈正相关,这一结果符合NLRP3炎症小体介导炎症反应和细胞焦亡的生物学特性,进而也提示激活NLRP3炎症小体与牙龈卟啉单胞菌感染加重慢性牙周炎的炎症反应和细胞焦亡有关。

本研究仅仅通过临床样本的检测结果展开讨论分析,虽然能够初步揭示NLRP3炎症小体在牙龈卟啉单胞菌感染加重慢性牙周炎病情、炎症反应和细胞焦亡中的作用,但未能通过细胞实验、动物实验获得NLRP3炎症小体对牙周组织健康状况影响的直接证实。此外,牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎常见的致病菌,除此之外也存在其他致病菌,今后可进一步探索牙周炎发病过程中不同类型致病菌激活NLRP3的特点,进而有助于全面认识牙周炎的分子生物学机制。