徐鲜钧，文佳珂，李 晋

（1.福建省武夷山生物研究所，福建 南平 354300；2.天津中医药大学中医药研究院，天津 301617）

钩藤为茜草科植物钩藤［Uncaria rhynchophylla（Miq.） Miq. ex Havil.］、大叶钩藤［Uncaria macrophylla Wall.］、毛钩藤［Uncaria hirsuta Havil.］、华钩藤［Uncaria sinensis （Oliv.） Havil.］或无柄果钩藤［Uncaria sessilifrudus Roxb.］的干燥带钩茎枝，具有清热平肝、熄风止痉的功效［1］。有研究表明：钩藤具有抗氧化、抗压、抗癫痫、抗焦虑、抗抑郁等多重药理作用［2-7］，临床常用来治疗神经及心血管系统疾病［8-9］，如高血压、癫痫、阿尔茨海默病等［10-11］。钩藤化学成分较复杂，主要含有生物碱、黄酮、三萜、酚类等，其中生物碱类成分［12］，尤其是钩藤碱与异钩藤碱被认为是钩藤发挥降压作用的主要活性成分［13］。然而，钩藤中的其他成分，如异去氢钩藤碱、毛钩藤碱以及一些酚酸类成分（绿原酸、隐绿原酸等）也存在降压活性［14-16］。

本研究以绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱4 种化学成分为考察指标，对2 个产地钩藤3 个不同部位（根、叶、带钩茎枝）的化学成分含量进行研究，通过含量差异分析，为钩藤质量研究及进一步的资源开发提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1200 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；G1314A1200 VWD 检测器（美国Agilent 公司）；超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；200T 粉碎机（武义海纳电器有限公司）；MSA225P-0CE-DU 十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；Milli-Q academic 超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.2 材料 超纯水（美国Millipore 公司）；甲酸（美国Anaqua Chemicals Supply 公司）；乙腈和甲醇（天津市康科德科技有限公司）。钩藤药材采集于福建省武夷山市五夫镇和上梅乡，经晒干或烘干后用于实验，经天津中医药大学常艳旭教授鉴定为钩藤［Uncaria rhynchophylla （Miq.） Miq. ex Havil.］。

1.3 对照品 绿原酸（批号：DSTDL002101）、异去氢钩藤碱（批号：DST200825-018）、毛钩藤碱（批号：DST210201-009），纯度均＞98.0%，均自购于成都德斯特生物技术有限公司；隐绿原酸（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-1803240，纯度≥99.07%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）。梯度洗脱，洗脱梯度为：0～5 min，5%～9%（B）；5～14 min，9%～9%（B）；14～23 min，9%～14%（B）；23～35 min，14%～18%（B）；35～55 min，18%～18%（B）；55～86 min，18%～35%（B）；86～88 min，35%～95%（B）。流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；波长：254 nm；进样体积：10 μL。钩藤样品溶液及混合对照品溶液色谱图见图1。

图1 钩藤混合对照品溶液及样品溶液色谱图

2.2 供试品溶液的制备 武夷山市五夫镇和上梅乡生产的钩藤鲜品晒干或烘干后，将其根、叶、带钩茎枝粉碎，过50 目筛，精密称取药材粉末0.50 g，加75%甲醇10 mL，超声（350 W，40 KHz）1 h，离心，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱对照品各1.00 mg，加甲醇配成浓度为1 mg/mL 对照品溶液，储存于4 ℃冰箱中备用。

2.4 供试品溶液的制备与考察

2.4.1 提取条件优化 ① 提取溶液浓度的选择：以4 种化合物总提取量为评价指标，当提取功率250 W、提取时间为40 min 时，分别考察25%、50%、75%甲醇及纯甲醇溶液对钩藤中绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱4 种化合物提取量的影响；② 提取时间优化：以4 种化合物总提取量为评价指标，当提取溶剂为75%甲醇溶液、提取功率250 W 时，考察提取时间为40、50、60、70 min 时对4 种化合物提取量的影响；③ 提取功率优化：以4种化合物总提取量为评价指标，当提取溶剂为75%甲醇溶液，提取时间60 min 时，考察超声功率为150、250、350、450W 时对4 种化合物提取量的影响。结果显示：75%甲醇溶液为最佳提取溶剂，60 min 为最佳提取时间，350 W 为最佳提取功率。

2.4.2 线性关系考察 取“2.3”项下的对照品溶液，配制绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱浓度分别为400、20、200、200 μg/mL 混合对照品溶液，再稀释成不同浓度的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下条件分析，以峰面积为Y 坐标，对照品浓度为X 坐标，绘制标准曲线，得到4 种化学成分的线性回归方程及线性范围，结果见表1。4 种化学成分在各自线性范围内线性关系良好。

表1 4种化学成分的线性关系考察结果

2.4.3 精密度考察 精密吸取钩藤叶部位的同一供试品溶液，连续进样6 次，记录峰面积。绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱4 种化合物峰面积的RSD 分别为2.77%、3.43%、4.84%、4.38%，保留时间的RSD 分别为0.05%、0.05%、0.03%、0.02%（n＝6）。4 种化合物峰面积和保留时间的RSD 均在5%以内，表明该方法精密度良好。

2.4.4 稳定性考察 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h 时进样分析，记录峰面积。绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱及毛钩藤碱4 种化合物峰面积的RSD 分别为1.59%、2.38%、2.34%、4.62%，保留时间的RSD分别为0.22%、0.24%、0.11%、0.06%（n＝6）。4 种化合物峰面积和保留时间的RSD 均在5%以内，表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性考察 取同一批药材，按“2.2”项下供试品制备方法同时制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，计算绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱及毛钩藤碱含量，并计算4 种化合物的RSD 分别为1.28%、1.89%、2.64%、0.95%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率考察 取钩藤叶粉末6 份，每份12.5 mg，精密称定，分别精密加入绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱、毛钩藤碱的对照品适量，各成分对照品的加入量与样品中各成分的含量相当；按“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进行测定，计算各化合物的加样回收率及RSD。绿原酸，隐绿原酸，异去氢钩藤碱，毛钩藤碱的加样回收率分别为97.0%、97.3%、102%、99.5%，RSD 分别为1.62%、2.50%、0.72%、1.29%。

2.5 样品含量测定 取2 个产地钩藤不同部位，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.1”项下色谱条件进行测定，计算绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱及毛钩藤碱含量，结果见表2。2 个产地钩藤不同部位4 种化合物含量存在差异：绿原酸、隐绿原酸在叶中含量较高，毛钩藤碱在根部含量较高；此外，异去氢钩藤碱在根部的含量相比于在带钩茎枝和叶2 个部位，含量相对较低。

表2 2 个产地钩藤不同部位4 种化学成分的含量 mg/g

3 讨 论

本团队通过对福建省武夷山市7 个乡镇野生钩藤药材资源的调查发现：五夫镇和上梅乡2 个地区的野生钩藤较为丰富。目前，关于该地区野生钩藤资源的研究尚未报道，因此，采用稳定可靠的分析方法，深入研究该产区野生钩藤质量，对进一步促进野生钩藤药材资源开发具有重要意义。故本研究以上述两地的钩藤为研究对象，通过优化的供试品溶液制备方法，来明确两地钩藤不同部位的绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱含量情况。

3.1 供试品溶液制备方法优化 本实验分别考察25%、50%、75%甲醇及纯甲醇溶剂，提取时间及提取功率对钩藤中绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱提取量的影响。以4 种化合物总提取量为评价指标，当提取溶剂为75%甲醇溶液（提取功率250 W，提取时间40 min），4 种化合物含量最高；提取时间60 min（提取溶剂为75%甲醇溶液，提取功率250 W），4 种化合物含量与70 min 相当，表明60 min 基本提取完全；提取功率350 W 时（提取溶剂为75%甲醇溶液，提取时间60 min），4 种化合物含量均高于其他提取功率。故供试品溶液制备方法最终确定为：以75%甲醇溶液为提取溶剂，超声提取60 min，提取功率为350 W。

3.2 含量差异分析 本实验建立了同时测定钩藤中4 种化学成分含量的HPLC-VWD 分析方法，经方法学验证，该方法稳定可靠。同时对比了4 种化学成分在钩藤3 个不同部位（根、叶、带钩茎枝）的含量，结果表明：2 种有机酸（绿原酸和隐绿原酸）在叶中含量较多，毛钩藤碱在根部含量较高，而异去氢钩藤碱在根部含量较低，2 个产地钩藤的实验结果相一致。此外，对比2 个产地钩藤4 种化学成分的含量：上梅乡钩藤叶部的绿原酸含量高于五夫镇钩藤，隐绿原酸含量则相反；五夫镇钩藤叶和根部的异去氢钩藤碱含量均高于上梅乡钩藤，带钩茎枝部的则相反，且五夫镇钩藤根部的毛钩藤碱含量高于上梅乡钩藤。

本实验通过建立HPLC-VWD 含量测定方法，对钩藤不同部位的4 种化学成分含量进行测定，方法学考察结果表明：本实验建立的同时测定钩藤中绿原酸、隐绿原酸、异去氢钩藤碱和毛钩藤碱含量的HPLC-VWD 分析方法精密度高、稳定性好，可用于钩藤中化学成分含量测定。这为钩藤药材的质量标准完善提供了参考。