刘龙飞，郭霞梅，罗超，张莉，王其龙

南京医科大学附属淮安第一医院中心实验室，江苏淮安 223300

食管癌是常见的上消化系统肿瘤，其发病率和病死率分别位居世界恶性肿瘤第8 位和第6 位。按照病理类型差异，食管癌可分为食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（EAC）［1-4］。食管癌在我国的发病率较高，患病人数占全球半数以上，且主要以ESCC 为主，其比例超过90%［5-6］。目前，手术切除、化疗、放疗及靶向治疗等为ESCC 治疗的主要方案，但由于其发病隐匿、进展快等特征，患者确诊时即已至中晚期，致使其5 年存活率较低，预后较差［7-8］。因此，深入探究ESCC 新的诊断标志物与治疗靶标具有十分重要的意义。谷丙转氨酶2（GPT2）是谷氨酰胺代谢中的一种重要转氨酶，能够催化丙氨酸与α-酮戊二酸（α-KG）可逆地生成丙酮酸和谷氨酸，从而为糖异生、三羧酸循环提供中间代谢产物，在多种组织的的葡萄糖、氨基酸及脂肪酸代谢过程中发挥重要作用［9-10］。据研究［11-12］报道， GPT2 可促进乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤的进展。然而，有关GPT2 在ESCC 中的表达情况及作用尚未见报道。2023 年1—8 月，本研究首先通过转录组测序筛选出差异表达基因GPT2，然后在临床样本中验证其表达水平及对ESCC 患者预后的影响，并进一步观察GPT2对ESCC 细胞增殖、迁移及侵袭的影响，以期为寻找有效的ESCC 诊断生物标志物及治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 组织、细胞、试剂及仪器 食管鳞癌组织及癌旁对照组织样本均取自本院80 例ESCC 患者，患者就诊之前均无其他恶性肿瘤病史，术前未接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗，且患者临床资料及出院后随访资料完整。将其中3对癌组织及癌旁组织进行转录组测序，筛选出ESCC组织中差异表达基因GPT2。同时将这80 例份癌组织制备组织芯片。本研究经南京医科大学附属淮安第一医院伦理委员会审批（KY⁃2023⁃103⁃01），患者均签署知情同意书。在TCGA 数据库中收集95 例份食管鳞癌、11 例份食管癌旁组织中GPT2 的表达水平。人食管鳞癌细胞系KYSE150、KYSE30购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清（FBS）、氨苄青霉素购于美国Hyclone 公司，SDS-PAGE 试剂购自美国Bio-Rad 公司，GAPDH 抗体、GPT2 抗体及二抗购自美国Proteintech 公司，结晶紫、BCA 蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，PCR 产物纯化试剂盒购于上海生工公司，高保真酶PrimeSTAR@Max DNA Polymerase、限制性内切酶Sal Ⅰ、SacⅡ和T4DNA 连接酶购于日本TaKaRa 公司，感受态细胞DH5α 购自南京诺唯赞公司，质粒提取试剂盒购自北京天根公司，Lipofectamine™ 3000试剂购自美国Thermo Fisher 公司，CCK8 试剂盒购于美国MCE公司。

1.2 ESCC 癌组织中GPT2 蛋白检测 ①采用Western blotting 法。向ESCC 组织匀浆中加入RIPA裂解液，并加入蛋白酶抑制剂PMSF，冰上裂解20 min，随后12 000 g 离心10 min，收集上清，使用BCA 试剂盒测定总蛋白浓度。取30 μg 蛋白上样进行SDS⁃PAGE 电泳， 接着PVDF 转膜，再用5%脱脂奶粉溶液室温下封闭2 h，分别孵育GPT2、GAPDH抗体于4 ℃冰箱过夜。第2 天用PBST 洗膜，加入二抗室温孵育1 h，PBST 再次洗膜后用ECL 发光液显影拍照。使用Image J 软件对蛋白条带进行定量分析，计算GPT2 蛋白的相对表达量。②采用免疫组化法。将食管鳞癌组织芯片石蜡切片制作成4 μm切片，经常规烤片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化等预处理，高温抗原修复15 min，3%过氧化氢处理，5%正常山羊血清封闭2 h，加入GPT2一抗（1∶100），4 ℃ 孵育过夜。次日加入HRP 标记的二抗（1∶500），室温孵1 h，随后使用DAB显色、苏木素复染后自来水冲洗，梯度乙醇脱水、二甲苯浸泡透明后干燥，然后中性树胶封片，使用组织芯片扫描仪进行扫描，并作定量分析。

1.3 GPT2 蛋白对ESCC 细胞增殖、迁移、侵袭能力影响观察

1.3.1 pIRES2/GPT2 过表达质粒的构建及提取在NCBI 上查找人GPT2 基因的CDS 序列，设计引物，PCR 扩增CDS 区，用PCR 产物纯化试剂盒回收目的片段，分别将目的片段及空载质粒（pIRES2）用限制性内切酶SalⅠ、SacⅡ进行双酶切，回收切割后的目的片段及空载质粒，在T4 连接酶的作用下16 ℃连接过夜。第2 天，将连接产物转化感受态细胞DH5α，涂板、挑单克隆后进行PCR 鉴定，将鉴定成功的单克隆送安徽通用公司进行测序。PCR 引物序列如下：5′-ACGCGTCGACATGCAGCGGGCG⁃GC-3′（正向引物），5′-TCCCCGCGGTCACGCG⁃TACTTCTCCAGG-3′（反向引物）。将含pIRES2 及pIRES2/GPT2 质粒的菌液按照1%比例加入30 mL含卡那霉素的LB 培养基中进行扩大培养，37 ℃摇床中培养12～15 h，离心收集菌体，使用天根质粒提取试剂盒按照说明书进行质粒抽提，用分光光度计测定质粒浓度，然后保存于－20 ℃冰箱。

1.3.2 ESCC 细胞培养、pIRES2/GPT2 过表达质粒转染 ESCC 细胞系KYSE150、KYSE30 培养于DMEM 培养基（含10% FBS、1%青霉素/链霉素）中，并放置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞密度融合至90%左右时，使用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3 进行细胞传代。将处于对数生长期的KYSE150、KYSE30 细胞种于6 孔板中（2×105个/孔），待细胞生长至70% ～ 80% 时，使用Lipo⁃fectamine™ 3000 试剂分别将3 μg pIRES2、pIRES2/GPT2 质粒转染至细胞（转染的细胞分别命名为pIRES2、pIRES2/GPT2 组），转染6 h 后换液，继续培养48 h 后收集细胞。采用Western blotting 法检测pIRES2、pIRES2/GPT2 组中GPT2 蛋白。结果显示，在KYSE150 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组GPT2蛋白的相对表达量分别为1.000 ± 0.225、7.165 ±0.899，KYSE30 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组GPT2 蛋白的相对表达量分别为1.000 ± 0.202、

10.916 ± 1.207，与pIRES2组相比，pIRES2/GPT2组GPT2 的蛋白相对表达量升高（P均＜0.05），以上结果表明，pIRES2/GPT2过表达质粒转染成功。

1.3.3 细胞增殖能力检测 采用CCK-8 实验。将pIRES2、pIRES2/GPT2 质粒分别转染至KYSE150、KYSE30 细胞中，48 h 后消化并计数，分别接种于96孔板中（5×103个/孔），每组设置5 个复孔，分别在接种24、48、72 h 加入10 μL CCK-8 试剂，放置培养箱中避光孵育1 h，然后用酶标仪测定450 nm 波长时每孔的吸光度（OD 值），以 OD 值代表细胞的增殖能力。

1.3.4 细胞迁移及侵袭能力检测 采用 Transwell迁移和侵袭实验。Transwell 细胞迁移实验：分别将转染后的KYSE150、KYSE30 细胞消化后重悬，调整细胞浓度为1×105个/mL，取100 μL 悬液加入到Transwell 上层小室中，下室加入600 μL 含10% FBS的培养液，培养箱中培养48 h。取出小室，4%多聚甲醛溶液中室温固定20 min，PBS 洗涤，1%结晶紫染色15 min，PBS 洗涤，用蘸水棉签轻轻擦拭上室中的细胞，置于室温干燥，最后在显微镜下随机选取5个视野进行拍照，计算各组穿过小室的细胞数。Transwell 细胞侵袭实验：用DMEM 将Matrigel 以1∶10 比例稀释，均匀铺于Transwell 上层小室内（100 μL/孔），置于培养箱中2 h，经细胞接种培养、固定及染色等过程（同细胞迁移实验），显微镜下随机取5个视野拍照计数。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料用±s表示，多组之间比较采用方差分析，两组之间比较采用t检验。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。生存风险因素分析采用多因素Cox 回归模型。生存分析使用Kaplan⁃Meier 法，生存曲线比较采用Log⁃Rank 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GPT2 蛋白在ESCC 组织中的表达变化及与患者临床病理特征、预后的关系 ESCC 组织转录组测序结果表明，ESCC 组织中GPT2 基因表达低于癌旁组织（log2FoldChange=－2.550，P＜0.05）。TCGA数据库数据分析结果显示，GPT2 蛋白在ESCC 组织中相对表达量为20.499 ± 10.077，癌旁对照组织中为54.107 ± 20.229；与癌旁对照组织比较，GPT2蛋白在ESCC 组织中相对表达量均下降（P均＜0.05）。Western blotting 结果显示，ESCC 组织、癌旁对照组织中GPT2 蛋白相对表达量分别为0.204 ±0.162、1.000 ± 0.318，两组比较，t=4.475，P＜0.05，见图1A。免疫组化结果显示，ESCC 组织、癌旁对照组织中GPT2 蛋白相对表达量分别为0.485 ±0.377、0.702 ± 0.367，两组比较，t=3.691，P＜0.05，见图1B。

图1 ESCC组织中GPT2蛋白表达

ESCC癌组织中 GPT2低表达与淋巴结转移存在正相关（χ2 =8.717，P＜0.05，见表1）。Cox 多因素比例风险分析结果显示，淋巴结转移、高病理分期和低表达GPT2 是ESCC 患者的生存风险因素［HR（95%CI）分别为2.541（1.472～4.387）、2.962（1.715～5.114）、1.983（1.146～3.433），P均＜0.05，见表2］。进一步将ESCC 患者按照GPT2 表达水平中位数分成高表达组、低表达组，高表达及低表达组患者生存率分别为45%（18/40）、22.5%（9/40），两组比较，Log-rankχ2= 6.247，P＜0.05。两组生存曲线见图2。

表1 GPT2蛋白表达与ESCC患者临床病理因素的关系

表2 食管鳞癌患者多因素Cox比例风险回归分析结果

图2 GPT2蛋白高、低表达的ESCC患者的生存曲线

2.2 GPT2 过表达的ESCC 细胞增殖、迁移、侵袭能力 接种24 h 时，KYSE150 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组OD 值分别为0.416 ± 0.070、0.402 ±0.037；48 h 时分别为0.787 ± 0.083、0.698 ± 0.090；72 h 时分别为1.897 ± 0.108、1.583 ± 0.102。KYSE30 细胞中，接种24 h 时，pIRES2、pIRES2/GPT2组OD 值分别为0.724 ± 0.034、0.704 ± 0.086；48 h 时分别为1.149 ± 0.073、0.918 ± 0.058；72 h 时分别为2.096 ± 0.102、1.758 ± 0.086。两种细胞中，与pIRES2 组相比，pIRES2/GPT2 组细胞的OD 值低（P均＜0.05）。接种24 h 时，KYSE150 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组迁移细胞数分别为（492.200 ±96.220）、（169.200 ± 49.350）个/HP；KYSE30 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组迁移细胞数分别为（386.800 ± 87.370）、（143.800 ± 35.490）个/HP。KYSE150 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组侵袭细胞数分别为（387.400 ± 71.180）、（140.800 ±43.870）个/HP；KYSE30 细胞中，pIRES2、pIRES2/GPT2 组侵袭细胞数分别为（423.800 ± 60.510）、（175.800 ± 62.830）个/HP。 两种细胞中，与pIRES2 组相比，pIRES2/GPT2 组迁移及侵袭细胞数减少（P均＜0.05）。

3 讨论

国际癌症研究中心全球统计报告指出，2020 年食管癌新发病例和死亡病例分别为60.4 万和54.4万。其中，中国新增食管癌病例数为32.4 万例，占比50%以上，且ESCC 病例占90%以上［1，13］。我国ESCC 的特征是恶性程度高、进展快，所以导致患者生存预后较差。尽管近年针对恶性肿瘤的靶向治疗、免疫治疗等取得不少进步，但除手术和放化疗外，ESCC 仍然缺乏有效分子靶向治疗手段［14-16］。因此，研究ESCC 发生、发展分子机制，可为寻找ESCC诊治新的分子靶标奠定一定的基础。

谷氨酰胺合成代谢和分解代谢之间的动态平衡在肿瘤发生过程中具有重要作用。谷氨酰胺代谢酶在多种肿瘤中表达异常，并且受到组织、癌基因等多种因素的影响［17］。丙酮酸/谷氨酸和丙氨酸/α-酮戊二酸之间的可逆性转氨作用由转氨酶GPTs 催化。GPTs 在多种组织中，如骨骼肌、肾脏及肝脏等的糖异生及氨基酸代谢中起重要作用［9］。GPT1 定位于细胞质中，在脂肪组织、肝脏中高表达，临床上常将其作为肝脏疾病的生物标志物。GPT2 又名丙氨酸酰基转移酶2（ALT2），是一种线粒体基质蛋白，在肌肉和脂肪组织中含量较高，表明其在葡萄糖、氨基酸和脂肪酸的代谢和稳态中发挥关键作用［18-19］。据报道，GPT2 在乳腺癌、结肠癌及肾细胞癌等肿瘤中表达上调［11，20］。然而，GPT2 在ESCC 中的表达情况尚不清楚。我们的研究结果发现，与癌旁对照组织相比，GPT2 在ESCC 组织中表达下调，与TCGA 数据库中的结果相一致，但与其他多数肿瘤中的发现不同，考虑此为不同类型肿瘤的异质性所致。此外，我们还发现淋巴结转移、高病理分期和低表达GPT2 是ESCC 患者的生存风险因素，且低表达GPT2 的患者预后较差，提示GPT2 可能可作为预测ESCC 预后的重要指标。

有学者指出，糖尿病患者肝脏中转录因子ATF4能够激活GPT2 的表达，沉默GPT2 可以降低丙氨酸诱导的高血糖［10］。ATF4也可通过上调GPT2表达增强胰岛 β 细胞的生存能力［21］。在ESCC 中，ATF4 表达下调，且ATF4 可诱导ESCC 细胞的凋亡［22-23］。提示ESCC 中ATF4 可能作为GPT2 的上游转录因子，调控其转录与表达。另有研究［24］发现，GPT2可通过激活Hedgehog 信号通路促进乳腺癌的干性，降低GPT2水平能够诱导自噬发生，抑制三阴乳腺癌的肿瘤生长［11］。有学者证实，长链非编码RNA UCA1 可通过上调GPT2 基因表达促进膀胱癌的肿瘤代谢过程［25］。在结直肠癌细胞中，PIK3CA 突变通过上调GPT2，使细胞更加依赖谷氨酰胺，从而促进肿瘤的生长［12］。有研究［17］发现，GPT2在间叶型胶质母细胞瘤中低表达，能够使谷氨酸合成谷胱甘肽增加，提高肿瘤细胞抗氧化能力及适应性。我们的研究表明，过表达GPT2 可抑制ESCC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。提示GPT2 低表达可促进ESCC 进展，其机制可能与上述文献报道结果一致。

综上所述，GPT2在ESCC组织中表达下调，且低表达GPT2 的ESCC 患者预后较差。另外，过表达GPT2不仅可抑制ESCC细胞的增殖，也可抑制ESCC细胞的迁移及侵袭能力，提示GPT2 在ESCC 发生发展中发挥重要作用，为ESCC 临床诊治靶点的开发提供了新的理论依据。