彭洁 卢英帅 齐志远 燕学东 武帅楷 郝杰 陈晓鹏

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.012

引用格式：

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收稿日期：2023-05-30；修回日期：2023-11-21

基金项目：山西农业大学高层次引进人才专项（2021XG008）；山西省科技厅平台专项（202104010910017）；国家自然科学基金项目（32271682）资助

作者简介：

彭洁（1999-），女，汉族，新疆沙雅人，硕士研究生，主要从事草地生态与管理研究，E-mail：p2500921567@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：chenxp@sxau.edu.cn

摘要：温度变化通过影响土壤甲烷代谢微生物及相关酶的活性进而影响草地生态系统CH4通量。为明确晋北赖草（Leymus secalinus）草地生态系统CH4通量随气温升高的变化趋势及机理，采用开顶箱法（Open top chambers，OTCs）设置5个梯度的增温处理，对增温第4年各处理生长季CH4通量及其影响因素进行测定。结果表明：增温显著提高了空气温度，但随着空气温度的增加，土壤温度和土壤体积含水量无显著变化；生长季晋北赖草草地生态系统是弱的大气CH4汇，其CH4平均吸收速率为（6.42±5.63） μg·m-2·h-1；增温显著影响CH4通量和pmoA功能基因丰度，与对照相比，只有W1处理促进CH4吸收通量；冗余分析表明土壤体积含水量是同时影响pmoA基因丰度和CH4吸收速率的关键因子。本研究可为预测未来气候变暖情境下草地生态系统CH4通量变化提供理论依据。

关键词：OTC；温室气体；功能基因；甲烷吸收

中图分类号：S891+.5    文献标识码：A      文章编号：1007-0435（2024）01-0113-08

Effects of Warming on Methane Flux in Leymus secalinus

Grassland in Northern Shanxi

PENG Jie1，2，3， LU Ying-shuai1，2，3， QI Zhi-yuan1，2，3， YAN Xue-dong1，2，3，

WU Shuai-kai1，2，3， HAO Jie1，2，3， CHEN Xiao-peng1，2，3*

（1. College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2. Shanxi Key

Laboratory of Grassland Ecological Protection and Native Grass Germplasm Innovation， Taigu， Shanxi Province 030801， China;

3. Youyu Loess Plateau Grassland Ecosystem National Research Station， Youyu， Shanxi Province 037200 ，China）

Abstract：Temperature changes affect soil methane metabolic microorganisms and related enzyme activities，which in turn affect CH4 flux in grassland ecosystems. To clarify the trends and mechanism of CH4 flux in Leymus secalinus grassland ecosystem under the trend of increasing temperature，the open-top chamber method was used to set up five gradient warming treatments，and the CH4flux and its influencing factors in the growing season of each treatment were measured in the fourth year of warming. The results showed that warming significantly increased air temperature，but with the increase of air temperature，soil temperature and soil volumetric water content did not change significant. During the growing season，the ecosystem of Leymus secalinus grassland in northern Shanxi was a weak atmospheric CH4 sink，an average absorption rate of （6.42±5.63） μg·m-2·h-1 CH4. Warming significantly affected CH4 flux and pmoA functional gene abundance. Compared with the control，only W1 treatment promoted CH4 uptake flux. Redundancy analysis showed that soil volumetric water content was a significant factor affecting both pmoA gene abundance and CH4 uptake rate. This study provides a theoretical basis for predicting CH4 flux changes in grassland ecosystems under different scenarios of future climate warming.

Key words：OTC;Greenhouse gas;Functional genes;Methane uptake

全球变暖是公认的事实，预计2030年全球气温比工业化之前上升约1.5℃［1］。据统计，1951年至2021年期间，中国地表年平均气温呈显著上升趋势，升温速率为0.26℃·（10年）-1，高于同期全球平均升温水平（0.15℃·（10年）-1）［2］。青藏高原地表气温自上世纪60年代至今平均每10 年升高0.37℃，升温速率为全球的近2倍［3］；而同期北极升温速率为0.63℃·（10年）-1，是同期全球升温速率的3.7倍［4］。表明在气候变暖大背景下，陆地生态系统在不同区域存在不同的增温强度。不同增温强度对陆地生态系统影响的差异性更加需要关注和研究，以便制定相应的应对措施，保护和维护地球上各个地区的生态平衡。

温室气体浓度的上升是全球气温升高的主要原因［5］。CH4是仅次于CO2的第二大温室气体，其百年尺度下增温潜势是CO2的28倍，对全球变暖的贡献率达四分之一［6］。大气中CH4浓度的变化由CH4源和汇的平衡决定，而土壤中的产甲烷菌和甲烷氧化菌的活动控制了陆地生态系统CH4通量变化［7］。研究表明，增温可通过改变土壤温度、土壤湿度、及土壤养分循环等影响产甲烷菌和甲烷氧化菌的活动［8-10］，进而调节草地生态系统土壤CH4通量变化。目前有关模拟增温对CH4通量影响的研究已在草地生态系统中广泛开展［7-10，11-20］。有研究预测，在1.5℃和3.0℃增温下，旱地土壤CH4吸收量增加可以抵消CO2排放增量的9%和7%［11］。然而，增温对草地（非湿地）土壤CH4通量影响的结果并不一致，绝大多数结果显示增温显著增加CH4的吸收［12-15］，例如在增温2.3℃条件下高寒草地土壤CH4吸收量比增温1.2℃时平均增加了7倍［12］，其原因在于增温增强了土壤水分蒸发以提高土壤孔隙中CH4和氧气含量，同时增强了甲烷氧化菌以及关键酶（甲烷单加氧酶）的活性。但也有研究表明增温对草地生态系统CH4吸收无显著影响［16-20］，例如研究发现分别增温1℃、2℃、3℃、4℃对纳木错高寒草甸土壤CH4通量无显著影响［18］，增温2.48℃对天山高寒草原土壤CH4吸收也无显著影响［20］。原因一是不同地区、不同类型草地土壤的水分状况、气体扩散、土壤/根际环境和微生物群落变化对气候变暖的差异化响应，例如，在干旱或半干旱的生态系统中，土壤微生物活动主要受土壤水分的限制，导致土壤CH4通量过程对温度变化的响应并不敏感［16］；二是与增温幅度的大小有关，例如有研究表明增温4.5℃高寒草甸土壤CH4吸收量显著增加，而增温2.4℃时无显著变化［15］。这是因为甲烷氧化菌对温度的变化较敏感，在5℃～10℃范围内甲烷的氧化作用逐渐上升，当温度上升到10℃～20℃范围时控制作用明显下降［21］，导致增温对草地生态系统土壤CH4通量的影响及其机制并不明确。

另外，目前国内外对草地生态系统CH4通量及其机制的研究多集中泛北极、青藏高原等高寒草地生态系统，以及在单一的增温处理下的效应，对不同增温强度对温带草地生态系统的研究较为少见。因此，研究温带草地生态系统CH4通量对增温强度的响应及其机制，对于明确草地生态系统碳源汇功能对气候变暖的反馈具有重要意義。本研究以晋北赖草草地生态系统为研究对象，设置5个梯度的增温处理，测定CH4通量及其潜在影响因素并分析其相关关系，拟解决以下科学问题：（1）随增温幅度增加，晋北赖草草地CH4通量如何变化？（2）增温强度通过影响哪些因素变化进而影响CH4通量？

1  材料与方法

1.1  研究地点

试验地点位于山西右玉黄土高原草地生态系统国家定位观测研究站（39°59′ N，112°19′ E，海拔1 348 m）。气候类型为温带大陆性季风气候，年平均降雨量和平均气温为425 mm和4.6℃（1991—2019年），月平均气温以7月最高（20.5℃），1月最低（-14.0℃），全年太阳总辐射量598 kJ·cm-2，年日照时数2 600～2 700 h，年均无霜期约为100～120天。优势种为赖草（Leymus secalinus），其他伴生种有碱蒿（Artemisia anethi folia）、草地风毛菊（Saussurea amara）、鹅绒委陵菜（Potentilla anserina）等。土壤质地为砂质壤土，该地区土壤类型为栗钙土［22-24］。

1.2  试验设计

增温试验平台于2018年3月启动，采用完全随机区组设计（图1），利用开顶式透明箱（Open top chambers，OTCs）进行增温试验，该装置用不锈钢边框将透明聚酯材料固定成六边形台状覆盖于草地之上，通过调节装置的高度控制增温效果［25］，设置0 cm（无玻璃的不锈钢边框）、40 cm、60 cm、80 cm、100 cm 5个高度（表1）为试验的5个增温处理：CK、W1、W2、W3、W4，每处理5个重复。

1.3  CH4通量测量

使用静态箱结合气相色谱仪测定各处理2021年生长季（5—10月）的CH4通量。采用尺寸为0.4 m×0.4 m×0.4 m的静态箱倒扣在0.4 m×0.4 m带凹槽的不锈钢方形基架上（嵌入地下5 cm）形成密闭环境，静态箱由不锈钢制成，并覆盖有保温材料以尽量减少箱内温度的变化。为了混合箱内的气体，在每个静态箱的顶部安装了一个小风扇，由12 V电源驱动。每次测量时，将静态箱放在方形基架上，用水注满凹槽密封。然后用注射器分别在0，10，20和30 min时从该箱中取出100 mL气体样品，并储存在气袋（Delin Tech，China）中。在室内，通过气相色谱仪（GC-7890B;Agilent Co.，U.S.A.）分析气体样品的CH4浓度。采样时间在晴天上午8：00—12：00，间隔10～15天进行。CH4通量计算方法如下：

Fi=ρi（V/A）（P/P0）（T0/T）（dci/dt）

其中Fi为通量速率，ρi为标准条件下的密度，V为气室容积，A为底部面积，P为气压，P0为标准气压，T0为标准温度，T为气温，dci/dt为CH4累积增长率［26］。

1.4  土壤含水量、土壤温度的测量

使用RC-4温湿度记录仪（RC-4HA/C，江苏精创电气股份有限公司）监测各处理距地表10 cm的空气温度，使用土壤温湿度自动监测系统（Em50，Decagon，U.S.A.）连续监测5厘米深度的土壤温度（Soil temperature，ST）和土壤体积含水量（Soil volumetric water content，VWC），以上数据每隔10分钟自动记录一次。

1.5  土壤取样和分析

2021年8月中旬在每个开顶箱内使用土钻（d=10 cm）随机取3钻0～10 cm的土壤，混合均匀后过2 mm筛去除植物残渣、可见根以及石砾。一部分样品风干后测土壤pH值，一部分样品储存在4℃下，测定微生物生物量碳（Microbial biomass carbon，MBC）和微生物生物量氮（Microbial biomass nitrogen，MBN）。土壤pH值采用电极电位法测定，取适量风干土，加入蒸馏水，配置成土水比为1∶2.5的溶液，用磁力搅拌器搅拌1 min后静置30 min，用pH酸度计（PHS-3C;INESA Co.，Shanghai，China）测定溶液的pH值。采用氯仿熏蒸－K2SO4浸提法测定微生物生物量碳、氮，微生物生物量碳、氮含量分别为熏蒸浸提液与未熏蒸浸提液中碳氮含量的差值除以转换系数0.45［27］、0.54［28］得到（总有机碳分析仪，TOC，Elementar vario，Germany）。

1.6  功能基因的测定

1.6.1  土壤DNA的提取  甲烷氧化菌控制土壤中的CH4吸收，几乎所有的甲烷氧化菌基因组都可编码pmoA基因，因此，本研究通过对pmoA基因丰度的测定来表征增温对土壤CH4氧化的潜在影响［29］。首先，称取0.3 g的冻干土壤（-20℃），按照Fast DNA SPIN试剂盒（MP Biomedicals，Carlsbad，CA，USA）的标准化流程提取土壤总DNA，然后根据NanoDrop-2000（Thermo Fisher Scientific，Madison，WI，USA）检验提取后的DNA浓度和260 nm和280 nm的光密度（Optical density，OD）值，须确保OD 260 mm/OD 280 mm取值范围在1.8～2.0之间。最后，将提取后的DNA在-20℃下保存，用于实时荧光定量PCR试验。

1.6.2  pmoA功能基因丰度的测定  通过StepOnePlus实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，Foster，CA，USA）并结合实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，q-PCR）的方法对pmoA功能基因的拷贝数进行定量分析，将提取的土壤总DNA作为模板对pmoA功能基因片段进行PCR扩增。选用20 μL反应体系作为q-PCR的反应体系：上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、DNA模板2 μL、0.4 μL ROX参比染料（50×）、无菌水6.8 μl和SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）10 μL。pmoA功能基因引物以及擴增条件的设定：上游引物为A189f：5′-GGNGA CTGGGACTTCTGG-3′，下游引物为Mb661r：5′-CCGGMGCAACGTCYTTACC-3′［30］。q-PCR扩增反应程序为：95℃预变性60 s，95℃变性15 s，56℃退火60 s，72℃延伸45 s，共设置40个循环。每个土壤样品重复三次，在定量分析的同时，将提纯后的含有目的基因片段的质粒DNA以1∶10的比率连续稀释后进行q-PCR扩增，构建标准曲线，pmoA功能基因的拷贝数通过标准曲线的阀域周期值计算得到，基因丰度以每克干土中基因拷贝数来表示。

1.7  数据分析

利用Excel 2021整理原始数据。不满足正态分布的数据，进行对数转换；当数据不满足方差齐性，则方差分析方法采用welch检验。使用SPSS（SPSS statistics 27.0，IBM，U.S.A.）进行重复测量方差分析（Repeated measure ANOVA），分析增温、月份及两者交互作用对土壤CH4通量、土壤温度和体积含水量的影响。用混合线性模型分析不同处理间土壤CH4通量、土壤温度、土壤体积含水量、pH、MBC、MBN、pmoA功能基因丰度的差异（增温为固定效应，不同的重复为随机效应，P<0.05则判定为显著）。使用Amos 28.0（SPSS Amos 28.0，IBM，U.S.A.）软件进行通径分析（χ2/df范围在1～3之间；P>0.05；近似误差均方根RMSEA<0.05；比较拟合指数CFI与拟合优度指数GFI～1.0则判断为最佳适配模型）。用Canoco 5.0软件（http：//www.canoco5.com）进行冗余分析（CH4吸收速率和pmoA功能基因丰度为响应变量，其他指标为指示变量，响应变量和指示变量夹角为锐角判定为正相关关系，钝角为负相关关系，直角为无相关关系，P<0.05为显著）。用Origin（Origin 2021，Origin Lab，U.S.A.）作图。

2  结果与分析

2.1  增温强度对环境因子的影响

开顶箱增温显著提高了晋北赖草草地生长季平均空气温度（图2a），与对照相比，W1，W2，W3，W4处理生长季平均空气温度分别增加了1.93℃、1.95℃、2.32℃、3.55℃（P＜0.05）。土壤温度和体积含水量具有明显的季节波动特征（表2）。开顶箱增温虽然显著增加了空气温度，但对土壤温度（图2b）和体积含水量（图2c）及其季节动态（增温×月份）均无显著影响。增温显著影响土壤MBC含量，与对照相比，W1和W2显著降低了土壤MBC含量（图2e），但增温对土壤pH（图2d）和MBN（图2f）无显著影响，且各处理之间均无显著差异。

2.2  增温强度对土壤pmoA基因丰度的影响

pmoA是控制土壤CH4氧化过程的关键功能基因，其丰度变化范围为0.24～3.33×106copies·g-1（图3）。增温显著影响pmoA基因丰度，W4处理pmoA基因丰度比W3和W1处理显著高约50%，其余各处理间pmoA基因丰度无显著差异。

2.3  增温强度对CH4通量的影响

晋北赖草草地生长季CH4通量范围在-23.17～18.40 μg·m-2·h-1（图4a），对照处理生长季平均CH4通量为-6.46±1.16 μg·m-2·h-1。5个处理CH4通量均呈单峰型季节变化趋势，生长季初期土壤CH4通量的吸收速率较低，在7月份出现吸收量峰值，随后逐渐减少，存在显著的季节性波动（表2）。增温显著影响晋北赖草草地生态系统CH4通量，W2处理CH4通量显著高于W1和CK，其余处理间CH4通量无显著差异（图4b），且增温对CH4通量的季节波动趋势无显著影响（表2）。

2.4  增温处理下CH4吸收与其潜在影响因素的相关关系

冗余分析（RDA）结果表明，第一和第二主成分对CH4吸收速率和pmoA基因丰度与潜在影响因素的解释率分别为26.92%和2.71%（图5a）。土壤体积含水量同时是pmoA基因丰度和CH4吸收速率的主要驱动因子（图5b），可解释pmoA基因丰度和CH4吸收速率18%的变化（P<0.05）。

2.5  增温强度影响晋北赖草草地CH4通量的途径

为阐明增温强度对CH4吸收速率及甲烷氧化菌关键功能基因pmoA丰度的影响路径，进行了结构方程模型分析，结果表明：增温影响CH4吸收的模型拟合失败；增温显著增加pH值，进而显著影响pmoA基因丰度，模型解释了不同增温强度下甲烷氧化菌关键功能基因pmoA丰度30%的变化（图6）。

3  讨论

甲烷氧化菌群落结构和活性随土壤温度、湿度以及其他环境条件（如pH和可利用氮含量）的变化而变化［31-35］。温度会影响甲烷氧化菌群落结构、丰度及其所产生酶的活性，湿度可影响土壤中CH4和O2的气体扩散，进而影响甲烷氧化速率［36］。开顶箱增温第4年显著增加了空气温度（1.93℃～3.55℃），但随着空气温度的增加，土壤温度和土壤体积含水量无显著变化，与已有研究在草地上的应用效果并不一致［8，12，17-18］。土壤温度对植被变化的敏感性高于气温，植被覆盖度较好会降低土壤热通量以降低土壤温度对气温的响应的敏感性［37］。而本研究中植被覆盖较好，地上生物量达到400 g·m-2［38］，减缓了气温升高对土壤温度的影响，导致增温强度并未显著影响土壤温度。一般而言，温度增加会促进土壤水分蒸发散失，引起土壤水分含量和土壤氧含量的变化，进而影响土壤中的动植物和微生物活动以及土壤CH4通量［39］。但在本研究中增温强度并未显著影响土壤温度，进而对体积含水量也无显著影响。

本研究中生长季平均CH4通量小于0，表明晋北赖草草地在生长季是大气CH4汇，这与其他草地（非湿地）研究结果一致［7-10，11-20］。晋北赖草草地生长季土壤CH4平均吸收速率为6.42 μg·m-2·h-1（图4），低于青藏高原高寒草地12.1 μg·m-2·h-1［15］和内蒙古典型草地41.2 μg·m-2·h-1［40］，不同类型草地生态系统的甲烷吸收速率可能受土壤温度、土壤含水量等多种因素影响［40-41］。晋北赖草草地pmoA基因丰度平均为0.91×106 copies·g-1（图3），低于内蒙古典型草原1.28×106 copies·g-1（土壤pH为7.17～8.47）、西藏高寒草甸1.81×106 copies·g-1（土壤pH为5.32～8.56）、新疆高寒草甸5.79×106 copies·g-1（土壤pH为7.93～8.86）［42］、青藏高原高寒草地2.00×106 copies·g-1（土壤pH为5.46～5.59）［34］，表明甲烷氧化菌丰度较低可能是晋北赖草草地CH4吸收速率较低。

土壤水分主要是通過影响土壤中CH4和O2的气体扩散与甲烷氧化细菌活性以影响土壤CH4氧化［43］。空气和水同时存在于土壤孔隙中，在土壤孔隙一定的情况下，一方容积增加另一方容积必然随之减少。土壤水分含量升高时，土壤空气减少，而CH4和O2的扩散受到限制，降低甲烷氧化菌的丰度和活性，进而降低CH4氧化速率，因此甲烷吸收和pmoA基因丰度与土壤体积含水量呈负相关关系［44-45］。本研究也发现，土壤体积含水量是CH4吸收和pmoA基因丰度的主要影响因子。

增温影响CH4吸收的模型拟合失败，可能是因为随着增温强度的增加CH4通量的变化并非是线性的，而结构方程模型是线性回归模型无法表征非线性变化。本研究发现，增温可通过增加土壤pH值进而提高土壤甲烷氧化速率。适宜土壤微生物活动的pH一般为中性，甲烷氧化菌的pH耐受范围为5.5～8.5［46］，但Martin等［47-48］发现随着土壤pH值变化，甲烷氧化菌种类会发生变化，进而导致在pH值为2.3的强酸性和12强碱性土壤中，甲烷氧化作用仍可发生。因此，土壤甲烷氧化菌在较高的pH值下可能保持活性。

4  结论

开顶箱增温显著提高了空气温度，但对晋北赖草草地土壤温度和体积含水量无显著影响；增温显著影响pmoA基因丰度和CH4通量，但增温对CH4通量的季节波动趋势无显著影响。土壤体积含水量是同时影响pmoA基因丰度和CH4吸收的关键因子。

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（责任编辑  彭露茜）