苏先芝,陆 华,黎欣韵,强玲侠,杨 茜

(1. 成都中医药大学附属医院,成都 610015;2. 成都中医药大学,成都 610015;3.电子科技大学医学院附属妇女儿童医院·成都市妇女儿童中心医院,成都 611731)

近年来,受生活节奏加快、自然环境污染等多种因素影响[1],不孕不育的发生率呈现快速上升趋势[2]。中医认为,肾藏精,主生殖,为先天之本、生殖之源。肾充则天癸至,任通冲盛,可以孕育子嗣;反之,肾虚则胞宫难以摄精成孕而发为不孕症。肾藏精,化为阴阳,肾虚证临床以肾阳亏虚、肾阴亏虚和肾精不足为主。研究肾虚证型对生殖器官的影响有助于解决女性不孕问题。同时,合适的动物模型及对动物模型的准确认识对研究中医肾虚证候及治疗机制具有重要意义。子宫血管与女性生育能力关系密切,子宫内膜血管化意味着有足够的子宫内膜容受性,而子宫内膜和子宫内膜下血流不足与妊娠率的显著下降有关[3]。因此,本文针对目前常用的三种肾虚造模方法:反复超促排致肾精亏虚法、甲状腺素联合利血平灌胃致肾阴亏虚法、4 ℃羟基脲灌胃致肾阳亏虚法进行对比性研究,观察肾虚诸证对雌性大鼠子宫血管灌注的影响,为临床和实验研究提供参考。本研究已通过成都中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审查,批件编号:2021DL-002。

1 材料

1.1 动物

50只SPF级雌性SD大鼠,6～8周龄,体质量180～220 g,购于成都达硕实验动物有限公司,动物许可证号:SCXK(川)2020-030。动物饲喂于成都中医药大学临床医学院实验动物中心,环境通风良好,温度20～24 ℃,相对湿度40%～79%,光照周期为12 h明/12 h暗,动物自由摄食摄水。

1.2 药物

复方利血平片,批号:201066,国药准字:H14023613,购自亚宝药业集团股份有限公司;甲状腺片,批号:200803,规格:40 mg,国药准字:H37020075,购自山东省惠诺药业有限公司;注射用绒促性素(human choionic gonadotophin,HCG),批号:201203,规格:2 000单位,国药准字:H44020673,购自丽珠集团丽珠制药厂;羟基脲片,批号:0E0413005,规格:0.5 g,国药准字:H37021289,由齐鲁制药有限公司提供。

1.3 主要试剂

孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin,PMSG)购自北京索莱宝科技有限公司,货号:20210329;大鼠血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)ELISA试剂盒(货号:MM-70867R1)、抗谬勒管激素(follicle-stimulating hormone,AMH)ELISA试剂盒(货号:MM-0575R11)、雌二醇(estrogen,E2)ELISA试剂盒(货号:MM-0551R)、孕酮(progesterone,P)ELISA试剂盒(货号:MM-0219R1),均购自江苏酶免实业有限公司;硫酸钡粉末购自德国Sachleben公司,货号:7727-43-7;医用明胶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,货号:9000-70-8。

1.4 主要仪器

Skyscan 1276 X射线显微断层成像仪,德国Bruker公司;95-1恒温磁力搅拌器,上海安亭电子仪器厂;TH212智能数字测温仪,北京鸿鸥成运仪器设备有限公司;RT-6100酶标分析仪,深圳雷杜生命科学股份有限公司。

2 方法

2.1 分组

大鼠适应性喂养后,每日早8:00起进行阴道脱落细胞学检测,连续1周光镜下观察,筛选出有规律动情周期的健康雌性大鼠48只进入正式实验。按随机数字表法分为4组:对照组、肾精亏虚组、肾阴虚组、肾阳虚组,每组12只。

2.2 肾虚三证大鼠模型的建立与取材

干预当天设为0 d,对照组大鼠予2 mL 0.9 %氯化钠溶液每日灌胃,连续21日;肾精亏虚组大鼠于0 d下午4时腹腔注射PMSG 40 IU/200 g,48 h后腹腔注射HCG 40 IU/200 g,间隔72 h重复1次,连续5次;肾阴虚组大鼠予甲状腺片和利血平灌胃,每日灌胃剂量分别为150 mg/kg与0.25 mg/kg,连续21日;肾阳虚组大鼠予4 ℃羟基脲混悬液以350 mg/kg剂量灌胃,连续21日。第22日起各组停止造模及给药,观察15日。36 d起将处于动情后期的大鼠麻醉后取材并处死,无动情周期大鼠选择非动情期取材。每组随机选取4只进行血管灌注,备微计算机断层扫描(microcomputed tomography,Micro-CT)检测,剩余大鼠腹主动脉取血并处死,取大鼠子宫,0.9%氯化钠溶液清洗后擦干、称重,置于4%多聚甲醛中固定。

2.3 观测指标

2.3.1 大鼠一般状况观察 观察并记录大鼠皮毛、活动情况、大小便和体质量等改变。自0 d起,每日晨8:00进行阴道脱落细胞涂片,观察动情周期,每3日测量肛温。

2.3.2 肾虚表征采集及检测 每2周观察并记录1次宏观表征,并根据《中医临床诊疗术语证候部分》[4],结合文献拟定肾虚症状、体征量化评分表进行评分[5],见表 1。

表1 大鼠肾虚表征采集量表

2.3.3 大鼠血液指标检测 血液标本离心后取上清液,严格按照试剂盒说明书操作,ELISA法测定血清FSH、AMH、E2、P水平。

2.3.4 子宫组织形态学观察 称重后将子宫分组浸入4%多聚甲醛中固定,常规石蜡切片与苏木精-伊红 ( hematoxylin-eosin staining, HE )法染色,光学显微镜下阅片,测量子宫内膜厚度、计数腺体数。

2.3.5 子宫血管灌注 参照文献方法制备硫酸钡-明胶混合对比剂[6]:将0.9 %氯化钠溶液、硫酸钡粉末、医用明胶按照20∶5∶1混合,置于37 ℃恒温磁力搅拌器中持续搅拌,直到约2 h后明胶完全溶解且均匀混合。大鼠麻醉后开腹,暴露腹主动脉,丝线结扎腹主动脉近心端,使用眼科剪由远心端在血管壁上剪一“V”形小口,将动脉套管尖端紧贴血管壁置入腹主动脉内,均匀压力灌注入37 ℃肝素溶液进行冲管,当血管内流动液体清亮,且推注过程无明显阻力增加,即代表冲管成功。冲管成功后灌注37 ℃硫酸钡-明胶混合对比剂,待子宫、肠壁血管完全呈白色后,即代表灌注成功,可停止操作。将灌注后的大鼠置于4 ℃冰箱中过夜,取子宫组织置于Micro-CT中,参数设定为球管电压55 kV,球管电流200 μA,曝光517 ms,层厚为10 μm。在大鼠左侧子宫距宫颈约1 cm处选取约1 cm3的兴趣区(region of interest, ROI),计算ROI内血管体积/组织体积比、各直径血管体积百分比、各级血管数和平均直径。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 一般情况及肾虚表征评分

如表2所示,各组大鼠初始体质量差异无统计学意义(P>0.05),造模后(21 d)及造模结束后15 d(36 d),肾精亏虚组大鼠体质量较对照组显著升高,肾阴虚组大鼠体质量显著降低(P<0.01)。如图1所示,造模期间,肾虚三证模型大鼠均出现动情周期逐渐紊乱,以肾精亏虚和肾阳虚组最为显著。 3 d起肾阴虚组大鼠肛温即出现显著升高,此后持续走高至39 ℃,21 d后肛温有所下降,但仍显著高于对照组;6 d起肾阳虚组大鼠肛温显著下降,此后持续偏低,21 d后有所回升但仍较对照组低;肾精亏虚组大鼠肛温与对照组比较差异未见统计学意义。造模后,肾精亏虚组大鼠摄食增多、反应迟钝、毛发枯槁、皮肉松软、缺乏弹性;肾阴虚组大鼠摄食减少、烦躁易怒、大便形小色黑,小便色黄赤,分散而卧,眼鼻、阴道出血;肾阳虚组大鼠摄食减少、毛发无光泽、弓背蜷缩、四肢及尾部发凉、耳部皮肤色苍白。

注:▲为造模干预起始日,↑为造模结束日图1 大鼠一般状况比较

表2 各组大鼠体质量比较

3.2 血清ELISA检测结果

如表3所示,与对照组比较,三模型组大鼠FSH显著升高,E2、P、AMH值均显著下降(P<0.05),与肾精亏虚组和肾阴虚组比较,肾阳虚组大鼠AMH值降低更显著(P<0.05)。

表3 大鼠血清ELISA检测结果比较

3.3 大鼠子宫组织形态学变化

如图2所示,对照组大鼠子宫内膜组织内可见丰富血管,腺上皮细胞核大、圆,形态无异常,腺体数目多、腺腔大。肾精亏虚组大鼠子宫内膜变薄,肌层肌纤维排列紊乱;肾阴虚组大鼠子宫内膜排列紊乱,皱襞明显增多,宫腔出血,子宫内膜腺体排列稀疏,固有层间质内存在炎性细胞浸润;肾阳虚组大鼠子宫内膜薄,腺体减少。如表4所示,与对照组比较,肾精亏虚组与肾阳虚组大鼠子宫内膜厚度均明显降低(P<0.05),子宫内膜腺体数显著减少(P<0.01);肾阴虚组大鼠子宫内膜厚度与子宫内膜腺体数虽较对照组有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。

A.对照组; B.肾精亏虚组; C.肾阴虚组; D.肾阳虚组图2 各组大鼠子宫HE染色结果(×40)

表4 各组大鼠子宫内膜厚度与腺体数比较

3.4 大鼠子宫血管构筑结果

3.4.1 血管体积/组织体积比及各直径血管体积百分比 各组大鼠子宫血管三维重建见图3。如图4所示,与对照组比较,肾虚三证模型组大鼠血管体积占比均下降(P<0.05),以肾阴虚组最为显著(P<0.01);肾精亏虚组大鼠子宫组织<0.05 mm直径血管体积百分比显著下降(P<0.01);肾阴虚组大鼠<0.05 mm和0.05～0.10 mm直径血管体积百分比升高(P<0.01),而>0.10 mm直径血管体积百分比显著下降(P<0.01);肾阳虚组大鼠<0.05 mm直径血管体积百分比显著升高(P<0.01),而>0.10 mm直径血管体积百分比显著下降(P<0.05)。

A.对照组; B.肾精亏虚组; C.肾阴虚组; D.肾阳虚组图3 各组大鼠子宫血管三维重建图

图4 大鼠子宫血管体积/组织体积比及各直径血管体积百分比(n=4)

图5 大鼠子宫各级血管平均直径(n=4)

3.4.2 各级血管平均直径 如图 5所示,与对照组比较,肾阴虚组大鼠一级、二级血管平均直径减少(P<0.05);肾阳虚组大鼠各级血管平均直径均减少(P<0.05);肾精亏虚组大鼠各级血管平均直径差异均未见统计学意义(P>0.05)。

3.4.3 各级血管数 如图6所示,与对照组比较,肾精亏虚组二、三、四级血管数均显著减少(P<0.01);肾阴虚组二、三、四级血管数亦显著减少(P<0.05);肾阳虚组各级血管数差异均未见统计学意义(P>0.05)。

图6 大鼠子宫各级血管数(n=4)

4 讨论

容受性高的子宫内膜是胚胎种植成功的必要条件之一,子宫内膜在雌孕激素的作用下发生一系列形态结构改变,包括内膜增厚、腺体增生、血液供应增加等,构成良好的着床微环境,胚泡才能够顺利着床[7]。证候是中医药理论体系的核心部分,能够反映疾病过程中某一阶段的病机,是对当前疾病状态的总结[8]。肾虚在中医学中被认为是不孕不育的常见原因,故中医肾虚证候动物模型对研究中药提高子宫内膜容受性的作用机制具有重要意义。肾主生殖,藏先后天之精,肾精化生肾气,主一身之阴阳,为天癸之源,肾气盛实方能摄纳胚胎[9]。肾气的强盛与否主要取决于两方面:一是肾精素禀是否充盛,二是肾精内部阴阳是否协调平衡[10]。因此肾虚者通常表现为肾精、肾阴或肾阳的虚衰。建立不同类型的肾虚证动物模型,观察其对生殖系统的影响,能够解析不孕症发生的生理病理机制并有助于预防和治疗药物的研发[11]。本文选取了目前应用较多也较具代表性的三种肾虚造模方法(反复超促排法[12]、甲状腺素联合利血平灌胃法[13]、冰羟基脲灌胃法[14]),以肾精亏虚、肾阴虚、肾阳虚证作为研究对象,观察此肾虚三证对大鼠生殖及子宫血管构筑的影响。

“肾主藏精”是中医藏象理论的重要内容之一,肾中所藏先天之精为肾主生殖的基础。“精血同源”,肾精虚损必然导致血液化生不足。有研究认为,促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)可能是肾精的物质基础[15],表明肾精亏虚很可能导致生殖相关血管及血供的改变。外源性激素诱导反复超促排卵广泛用于辅助生殖技术,研究表明反复超促排卵会影响卵母细胞的质量[16]。本团队前期采用PMSG联合HCG反复超促排卵的方法成功构建了肾精亏虚型生育力低下的雌鼠模型[17]。本研究发现,肾精亏虚组大鼠肾虚证候评分显著升高,90 %以上大鼠出现动情周期紊乱,FSH升高,AMH、E2、P显著降低,子宫内膜厚度减小,腺体数减少,表明该造模法同时造成了子宫内膜容受性的改变。进一步发现肾精亏虚组大鼠子宫血管构筑也发生了变化,这种变化主要表现在血管占比减少和二、三、四级血管数量减少,而并未对各级血管直径产生影响。

肾阴虚指因肾阴亏损、失于滋养、虚热内生而表现出的证候[18],研究表明肾阴虚患者微血管数增多,可能为其原发病不良预后的原因之一[19]。甲状腺素联合利血平造模可模拟体温升高、多汗等类似肾阴虚的现象[20],是目前肾阴虚证应用最广的造模方法[21]。本研究中,肾阴虚组大鼠出现了烦躁易怒、消瘦、便干溲赤、阴道出血、肛温升高等改变,同时大鼠出现动情周期紊乱,FSH升高,AMH、E2、P降低,子宫内膜组织形态学发生变化,表明该造模方法除引起肾阴虚表征证候改变外,还造成了雌鼠生殖系统的功能异常。本研究中肾阴虚组大鼠子宫一、二级大血管管径减少、二级血管数量减少,微血管体积占比相对增大而数量减少,提示终末微血管管径较正常增粗,子宫组织血供减少而毛细血管扩张,引起子宫出血。

肾中阳气具有温煦、推动、蒸腾、气化的作用,“诸寒收引,皆属于肾”(《素问·至真要大论篇》),若肾阳不足,阴寒内盛,筋脉收引而挛急,血络凝滞不畅,则会引起血管收缩而使组织器官血供不足。羟基脲可抑制核苷酸的代谢与DNA的合成,模拟下丘脑-垂体-靶腺轴受抑制的病理状态,使动物表现出毛发枯槁、精神萎靡,蜷缩、消瘦等“肾阳虚”的症状[22],冰羟基脲灌胃法是本课题组在前期研究基础上优化后的肾阳虚造模方法,可以更敏锐地建立肾阳虚证不孕的动物模型[14, 23]。本研究中,肾阳虚组大鼠出现弓背蜷缩、肛温下降、动情周期紊乱等肾阳虚证候,血清FSH显著升高,AMH、E2、P显著降低,子宫内膜变薄,腺体数显著下降,表明该造模方法引起了雌性大鼠生殖系统的显著改变,与前期结果一致[14]。本研究还发现该肾阳虚不孕雌鼠模型子宫大血管体积占比显著下降,各级血管数量未有显著变化而直径均显著下降。肾阳不足则虚寒内生,肾阳的温煦、推动作用减弱,且寒主收引,故出现各级血管管径减小,子宫组织血供减少可导致子宫内膜变薄、腺体减少,致使胞宫难以摄精成孕。

肾中精气可化生血液,以灌充血脉,气血为人体阴阳之基础[24]。《素问·奇病论篇》曰“胞络者系于肾”。胞脉即为胞宫的血脉,胞络实际是胞宫上的脉络,是肾中精气输注于胞宫的道路[25]。胞宫、胞脉、胞络正常运行并且相互作用,才能使子宫内膜易于受胎。若胞络失畅、胞脉不充,则胞宫失司难以摄精成孕。本研究中,三种肾虚模型大鼠均表现出肾虚证候,出现血清性激素改变、动情周期紊乱等,表明肾精、肾阴或肾阳任一的虚损均可导致卵巢功能的下降。但子宫组织形态学却产生了不同的改变,肾精亏虚证大鼠子宫内膜腺体减少,血管数量减少;肾阴虚证大鼠子宫出血,大血管管径减小而微血管增粗;肾阳虚证大鼠子宫内膜变薄,各级血管管径减小。本研究结果表明子宫血管的变化可能是雌鼠生殖功能、子宫内膜容受性下降的原因之一,可为中医药“同病异治”及改善不同证型的子宫血管血供提供研究基础。