谢卓庭， 王乃平， 程晓榆， 李坤寅

（1.广州中医药大学东莞医院，广东东莞 523000；2.广州中医药大学第三附属医院，广东广州 510375）

子宫平滑肌瘤（简称子宫肌瘤，uterine fibroids）是生殖系统最常见的妇科肿瘤，20%~40%性成熟女性患有此病，近些年子宫肌瘤女性妊娠患者比例增多[1-2]。目前，西医治疗子宫肌瘤有激素药物，非激素药物如止血剂、非甾体抗炎药，手术及放射疗法等手段[3]，但备孕子宫肌瘤患者在选择这些治疗方式时有所顾虑，往往偏向寻求能够保障生育的中医治疗。子宫肌瘤归属于中医学“癥瘕”范畴，气滞血瘀证是最常见的临床证型，然而临床观察发现，备孕子宫肌瘤女性常需固复正气。中药复方制剂橘荔散结丸具有行气活血、消癥散结的功效，治疗子宫肌瘤具有良好的临床疗效，尚可同时固复患者正气[4]。

本研究团队的李坤寅教授指导并带领团队围绕橘荔散结丸治疗子宫肌瘤展开了一系列研究。团队前期成功构建了人子宫肌瘤细胞模型，并验证了橘荔散结丸醇提物可下调子宫肌瘤细胞表皮生长因子受体（EGFR）表达[5]，降低子宫肌瘤细胞增殖能力，从而发挥对子宫肌瘤的抑制作用；团队还成功构建了大鼠荷子宫肌瘤组织移植瘤动物模型，发现橘荔散结丸可下调微小RNA-21（miR-21）抑制Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路进而抑制子宫肌瘤细胞增殖[6]。但其作用机制仍不完全清楚。研究[7-8]表明，子宫肌瘤细胞增殖与氧化应激关系密切，Wnt/糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）/β-catenin 信号通路是氧化应激的经典通路。因此，本研究在对橘荔散结丸醇提物化学成分进行超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱串联质谱（UHPLC-QE-MS）分析[9]的基础上，从Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路角度在细胞水平探讨橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞增殖的抑制作用及机制，以期为橘荔散结丸的临床应用提供更多的科学依据，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1. 1 药物及制备橘荔散结丸（由橘核、荔枝核、小茴香、乌药、川楝子、益母草、海藻、莪术、何首乌、续断、岗稔根、党参、生牡蛎、风粟壳组成，由广州至信药业有限公司生产，批号：190901、191201、200601）。对照品：橘荔散结片（广州中医药大学第一附属医院院内制剂，批号：20200501、20200701、20200901）。米非司酮片（北京紫竹药业有限公司生产，批号：RU486，25 mg/片）。

橘荔散结丸醇提物制备：碎成粗粉按1∶8料液比加入70%酒精，回流提取2次，每次1 h，收集醇液，再应用旋转蒸发仪浓缩至无醇味，冷冻干燥成冻干粉。

所有药物使用时均用DMEM 培养液稀释，0.22 μm无菌微孔滤膜过滤，配制成不同浓度的含药液，pH值为中性。-20 ℃保存备用。

1.2 仪器1290 UPHLC仪（Agilent公司）；Q Exactive Focus 高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm，美国Waters公司）；PM-20全自动显微照相倒置式系统显微镜（日本Olympus 公司）；ALTRA EPICS 型流式细胞仪（美国Beckman Comlter 公司）；蛋白电泳装置系统（美国Bio-Rad公司）；7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 试剂DMEM、胎牛血清、青-链霉素溶液、0.25%胰蛋白酶、PBS 缓冲液（美国Gibco 公司）；Ⅰ型胶原酶（德国BioFroxx公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，Biosharp 公司）；Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和基质金属蛋白酶2（MMP2）抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）（Ser9）抗体（CST 公司）。甲醇（CAS：67-56-1）、乙腈（CAS：75-05-8）、甲酸（CAS：64-18-6）：LC-MS 级（CNW Technologies 公司）；L-2-氯苯丙氨酸（CAS：103616-89-3，上海恒柏生物科技有限公司生产，纯度≥98%）。

1.4 橘荔散结丸醇提物活性成分鉴定橘荔散结丸醇提物冻干粉及橘荔散结片各3批样本，每份样品1 g。活性成分鉴定的色谱条件[10]：Waters UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）。进样量5 μL，流速为0.4 mL/min。流动相为0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B），多步线性洗脱梯度程序：0~3.5 min，5%~15%B；3.5~6 min，15%~30%B；6~12 min，30%~70%B；12~18 min，70%~100%B；18~25 min，100%B；25~26 min，100% ~ 5%B；26 ~ 30 min，5%B。活性成分鉴定的质谱条件：每个采集周期中，质量范围在100~1 500 之间，采用加热电喷雾离子源，正、负离子模式检测。具体详细参数设置如下：毛细管温度：400 ℃；鞘气体流速：45 Arb；辅助气体流速：15 Arb；MS 全分辨率：70 000；MS/MS 分辨率：17 500；碰撞能量：15/30/45（NCE 模式）；喷射电压：4.0 kV（正极）或-3.6 kV（负极）。方法学验证符合标准。

1.5 细胞实验

1.5.1 细胞来源及原代培养 培养人原代子宫肌瘤细胞。病例来源：2021 年1 月至2022 年06 月于广州中医药大学第三附属医院妇科住院需行子宫全切术或子宫肌瘤剔除术的子宫肌瘤患者共20例，病理检査确诊为子宫肌瘤组织。本研究方案已获得广州中医药大学第三附属医院伦理委员会许可（伦理号：【2020】016）。

手术室用无菌剪获取病灶组织约2 cm3，立即置于冰浴磷酸盐缓冲液（PBS）中，送广州中医药大学岭南妇科实验室行原代培养。细胞置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，当生长融合达80%，胰蛋白酶消化、离心细胞悬液，按1∶2 分装接种传代，传至第3代时采用免疫组织化学法鉴定原代人子宫肌瘤细胞。

1.5.2 CCK-8法测定细胞增殖抑制率 将原代人子宫肌瘤细胞（1×106个/mL）接种到96 孔板，24 h后吸出培养基，加入橘荔散结丸醇提物不同浓度（0、0.1、1、2、10 mg/mL）含药液，每孔100 μL，每组设4个复孔。12、24、48 h后，再次吸出各孔培养基。避光条件下各孔加入含CCK-8 培养基10 μL 孵育2 h。待颜色变为橙色，酶标仪检测吸光度（OD）值，波长设为450 nm。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组的OD/空白对照组的OD）×100%。

1.5.3 分组与干预方法 将人子宫肌瘤细胞接种于6 孔板（1 × 105mL/孔），每孔2 mL。分为5 组：空白对照组，加入不含药液DMEM 培养液；二甲基亚砜（DMSO）组，加入含0.05%DMSO 培养液；橘荔散结丸高、低浓度组，依据“1.5.2”项实验结果，加入含橘荔散结丸醇提物2、1 mg/mL的DMEM培养液；米非司酮组，加入含米非司酮1×10-5g/L的DMEM培养液。置于37 ℃培养箱继续培养48 h。以下流式细胞术、Western Blot、qPCR法按此分组给药。

1.5.4 流式细胞术检测细胞周期 胰酶消化收集按“1.5.3”项干预后的细胞，去上清，PBS洗1次，加入预冷70%乙醇，4 ℃固定过夜。将固定细胞离心去70%乙醇固定液上清，加入1 mL PBS 液室温重悬细胞5 min 后再次离心去上清。避光条件下，每管加入500 mL PI 染色液（每mL 染色缓冲液加入20 μL RNase A和25 μL PI储液），室温染色30 min。流式细胞仪上机检测，分析实验结果采用Modifit软件。实验重复3次。

1.5.5 Western Blot 法检测子宫肌瘤细胞Wnt 5b、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR 和MMP2的蛋白表达水平 取出按“1.5.3”项干预后的细胞，裂解、离心提取蛋白。对蛋白样品电量、变性处理，上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭。以β-actin为内参，先后加入一抗（稀释度1∶2 000）和二抗（稀释度1∶5 000）孵育。显影。采用ImageJ软件系统分析数据，目标蛋白表达水平以目标蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值比值表示。

1.5.6 定量聚合酶链反应（qPCR）法检测子宫肌瘤细胞Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2 mRNA表达水平 从GenBank数据库检索相应基因序列，设计引物见表1。提取RNA，取1 μL RNA样品，分光光度计测定OD260/280，计算RNA 浓度和质量。逆转录条件：42 ℃，30 min；95 ℃，5 min。PCR扩增：Stage 1预变性：95 ℃、3 min。Stage 2循环反应：95 ℃、10 s；55 ℃、30 s；72 ℃、1 min，共循环35 次。Stage 3：72 ℃、10 min。ΔCT=CT（目的基因）-CT（内参基因）；ΔΔCT=ΔCT（处理组）-ΔCT（对照组）。采用2-ΔΔCT法计算目的基因的相对表达量。GAPDH为内参。

1.5.7 统计方法 采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析，实验结果为计量资料满足正态分布，以均数±标准差（±s）表示。多组样本数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 橘荔散结丸醇提物主要化学成分鉴定按照UHPLC-QE-MS技术条件检测，得到橘荔散结丸醇提物正离子模式总离子流TIC 图（见图1）。通过自建数据库比对与查阅参考文献，发现正离子模式能检出更多化合物，橘荔散结丸醇提物和橘荔散结片共分离出663 个化合物（包括195 个萜类，105 个黄酮类，79 个生物碱类，69 个苯丙素类，43 个酚类及其他类型等）。相对含量占总化合物85%的化学成分被认为是橘荔散结丸醇提物的主要化学成分，共有155个（包括冻干粉91个，中成药64个）。橘荔散结丸醇提物冻干粉与中成药橘荔散结片的主要化学成分共有22个（包括水苏碱、胍基丁酸、地芰普内酯、原莪术烯醇、甜橙黄酮、花椒内酯等）。结果表明，橘荔散结丸化学成分众多，药物组成复杂。

图1 橘荔散结丸正离子模式总离子流TIC图Figure 1 TIC diagram of total ion flow in positive ion mode of Juli Sanjie Pills

2.2 橘荔散结丸醇提物指纹图谱的建立将橘荔散结丸醇提物及对照品橘荔散结片检测所得化学成分质谱原始数值，在正离子条件下进行排序，经过多点较正、谱峰匹配，得到橘荔散结丸醇提物（S1~S3）及橘荔散结片（S4~S6）共6批样品指纹图谱叠图，见图2。结果显示，指纹图谱重叠较好，表明橘荔散结丸醇提物质量稳定，而差异主要由于剂型及制备工艺所致。

图2 橘荔散结丸醇提物正离子模式指纹图谱Figure 2 Positive ionisation pattern fingerprints of the alcoholic extract of Juli Sanjie Pills

2.3 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞增殖的影响图3 结果显示：橘荔散结丸醇提物0、0.1、1、2、10 mg/mL 处理12、24、48 h 后，子宫肌瘤细胞抑制率显著增加，与0 mg/mL组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。1 mg/mL 组细胞抑制率在12 h 时与2 mg/mL 组比较，差异无统计学意义（P= 0.092＞0.05）；2 mg/mL 组细胞抑制率在24、48 h 时与10 mg/mL 组比较，差异无统计学意义（P=0.176＞0.05）。表明橘荔散结丸醇提物可显著抑制子宫肌瘤细胞增殖，且呈一定时间浓度依赖性。橘荔散结丸醇提物浓度为1、2 mg/mL，处理48 h 时能较好地抑制子宫肌瘤细胞增殖，故将这2个剂量设为高、低浓度组。

图3 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞增殖的影响Figure 3 Effect of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the proliferation of uterine fibroid cells

2.4 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞周期的影响图4、图5 结果显示：DMSO 组G0/G1 期和G2/M 期的细胞数与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；橘荔散结丸醇提物高、低浓度组G0/G1 期细胞数大于空白对照组，而G2/M 期细胞数小于空白对照组（均P＜0.05）。组间比较，橘荔散结丸醇提物高、低浓度组G0/G1 期和G2/M期的细胞数有显著性差异（P＜0.05），而橘荔散结丸醇提物高浓度组G0/G1 期和G2/M 期的细胞数与米非司酮组无显著性差异（P＞0.05）。

图4 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞周期的影响Figure 4 Effect of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the cell cycle of uterine fibroids

图5 流式细胞术检测子宫肌瘤细胞周期结果Figure 5 Flow cytometry for cell cycle results in uterine fibroids

2.5 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白表达的影响表2、图6结果显示：各组子宫肌瘤细胞GSK-3β蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与空白对照组比较，橘荔散结丸醇提物高、低浓度组及米非司酮组子宫肌瘤细胞Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2的蛋白相对表达量均降低（P＜0.05）；橘荔散结丸醇提物高浓度组Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR 和MMP2的蛋白相对表达量均低于橘荔散结丸醇提物低浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；与米非司酮组比较，橘荔散结丸醇提物高浓度组肌瘤细胞Wnt 5b 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），余蛋白表达水平无显著性差异（P＞0.05）。

图6 Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白的Western Blot条带Figure 6 Western Blot strips of key proteins of the Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway

表2 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白表达水平的影响Table 2 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine leiomyoma cells（±s）

表2 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白表达水平的影响Table 2 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on the expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine leiomyoma cells（±s）

注：①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.01，与橘荔散结丸醇提物低浓度组比较；③P＜0.05，与米非司酮组比较

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2.6 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路关键蛋白mRNA 表达的影响表3结果显示：与空白对照组比较，橘荔散结丸醇提物高、低浓度组及米非司酮组子宫肌瘤细胞Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR、MMP2 的mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）；橘荔散结丸醇提物高浓度组Wnt 5b、GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2的mRNA相对表达量均低于橘荔散结丸醇提物低浓度组，差异有统计学意义（P＜0.05）；橘荔散结丸醇提物高浓度组上述各指标与米非司酮组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表3 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达水平的影响Table 3 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on mRNA expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine fibroid cells（±s）

表3 橘荔散结丸醇提物对子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路关键蛋白mRNA表达水平的影响Table 3 Effects of alcoholic extract of Juli Sanjie Pills on mRNA expression levels of key proteins of Wnt/GSK-3β/β-catenin signalling pathway in uterine fibroid cells（±s）

注：①P＜0.05，与空白对照组比较；②P＜0.01，与橘荔散结丸醇提物低浓度组比较

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3 讨论

子宫肌瘤常见经量增多或延长、下腹包块、压迫疼痛、腰腹坠胀等症状，根据与子宫肌壁关系分为肌壁间肌瘤（肌瘤位于子宫肌壁间）、浆膜下肌瘤（肌瘤向子宫浆膜面生长）和黏膜下肌瘤（肌瘤向宫腔方向生长）[11]。黏膜下肌瘤对妊娠影响较直接，它影响胚胎种植与着床，增加流产与胎盘早剥风险[12]。肌壁间肌瘤与浆膜下肌瘤若选择手术方式剔除，增加瘢痕妊娠和剖宫产大出血风险[13]。因而具有生育要求的女性大多选择中医药治疗。橘荔散结丸全方系由全国名中医罗元恺教授根据《普济方》荔核散及《济生方》橘核丸加减化裁而成，以行气活血、消癥散结攻伐为主，补益正气为辅，含行气散结类药橘核、荔枝核、乌药、小茴香、川楝子，活血消癥类药莪术、牛膝、益母草，软坚消肿类药海藻、醋鳖甲、风栗壳，收敛补益类药牡蛎、岗稔根、党参、续断、何首乌。

UHPLC-QE-MS技术具有色谱高分离能力和质谱高鉴别能力，广泛用于药物分析检测[9]。本研究应用UHPLC-QE-MS 技术对橘荔散结丸醇提物化学成分进行鉴定，建立总离子流图和指纹图谱，分离出其主要化合物包括萜类（如地芰普内酯及川续断皂苷Ⅵ）、黄酮类（如槲皮素及橙皮苷）、生物碱类（如水苏碱及甜菜碱）、苯丙素类（如花椒内酯）等。现代药理学研究表明：橘荔散结丸中荔枝核主要成分槲皮素通过减少氧化应激下调活性氧介导下游信号通路、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统等方式，发挥抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理作用[14]；橘核主要成分橙皮苷能抑制GSK-3β信号级联引起肿瘤细胞凋亡[15]；益母草成分水苏碱对小鼠子宫平滑肌有较强的兴奋作用，能促进子宫收缩复旧[16]，成分甜菜碱可通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路调节改善血脂代谢和免疫应答，提高睾丸抗氧化能力[17]；续断主要成分川续断皂苷Ⅵ可激活原代蜕膜细胞和HELA细胞孕激素受体（PR）基因启动子，有助于降低子宫收缩维持受孕[18]。

本研究通过细胞实验证实，橘荔散结丸醇提物能够抑制子宫肌瘤细胞增殖。细胞增殖是细胞分裂和细胞损失平衡的动态过程，体细胞通过有丝分裂过程进行增殖，由细胞周期进程所决定[19]。当体细胞增殖时，细胞周期进程受到正或负信号调节。细胞周期进展为G1、S、G2、M 四个阶段，这个过程有赖于细胞周期蛋白依赖激酶和细胞周期蛋白调节[20]。本研究结果表明，橘荔散结丸醇提物可有效阻滞肌瘤细胞从G0/G1 期进展到G2/M期，抑制肌瘤细胞增殖，从而控制肌瘤生长。

细胞周期、增殖、凋亡与氧化应激密切相关，而子宫肌瘤的发生与氧化应激关系密切。Wnt/GSK-3β/β-catenin信号通路是一种具有调节多种细胞功能包括细胞增殖、凋亡、迁移、发育过程中的细胞极性及干细胞维持，是氧化应激的经典通路[21]。研究发现，平滑肌瘤细胞中Wnt 5b 和sFRP1转录水平均显著升高[22]；而Wnt 配体可以激活EGFR 信号通路，EGFR 又可通过PI3K/Akt 通路激活β-catenin，且EGFR 已被证明与β-catenin 形成复合物并增加细胞的侵袭和转移[23]。基质金属蛋白酶2（MMP2）是降解细胞外基质蛋白，主要是Ⅳ型胶原的蛋白水解酶。在平滑肌瘤和肌层中，Ⅳ型胶原均局限于平滑肌细胞的细胞外基质包埋束，子宫平滑肌瘤的发病机制和生长与MMP2 有关[24]。本研究结果表明，橘荔散结丸醇提物能够下调子宫肌瘤细胞Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路中Wnt 5b、p-GSK-3β、β-catenin、EGFR和MMP2蛋白和mRNA 的表达，说明橘荔散结丸醇提物可通过抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路传导，抑制氧化应激反应，从而达到抑制肌瘤生长、缩小子宫肌瘤的作用。

综上所述，本研究应用UHPLC-QE-MS 技术分离的橘荔散结丸醇提物化学成分众多，主要成分具有氧化应激调节作用，并建立了橘荔散结丸醇提物指纹图谱，药物质量评价稳定。通过细胞实验论证显示，橘荔散结丸醇提物可有效抑制子宫肌瘤细胞增殖，其分子机制与抑制Wnt/GSK-3β/β-catenin 信号通路关键蛋白表达，进而干预子宫肌瘤细胞微环境氧化应激反应有关。