曾瑜 边亚芹 杨怡春 彭冬先

(1.南方医科大学珠江医院,广东 广州 510280;2.南方医科大学第二临床医学院,广东 广州 510280;3.深圳市龙岗中心医院,广东 深圳 518100)

复发性流产是一种患者连续发生≥3次,20周前妊娠产物丢失的病理性妊娠状态,与感染、遗传及内分泌等因素有关[1-2]。目前仍有约50%复发性流产患者尚未发现原因,称为原因不明复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA),导致患者再次妊娠失败的风险增加[3]。研究表明,绒毛血管增生、滋养细胞增殖对正常妊娠至关重要,在孕早期,绒毛外滋养细胞进入中螺旋动脉,增加胎盘血供,维持妊娠需求[4-5]。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是调节血流灌注的重要因子,在促进胚胎存活方面发挥重要作用[6]。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)由蛋白质氨基酸侧链经甲基化修饰水解后形成,是一种内源性NO合成酶抑制剂,ADMA可通过减少NO的产生损害内皮细胞功能,从而对胎儿发育造成不良影响[7-8]。然而目前关于ADMA与URSA的相关性尚不明确,因此,本研究以URS患者为研究对象,旨在探讨ADMA在URSA患者血浆及绒毛组织中的表达其临床意义,以期为临床治疗提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月-2021年12月南方医科大学珠江医院收治的URSA患者168例为研究对象,采用计算机产生随机数法将就诊患者以3∶1的比例分为训练集126例(URSA组)和测试集42例,分别用于构建风险预测模型和验证模型预测效能。另选取同期于我院进行终止妊娠的126例孕妇作为对照组。纳入标准：①自然流产次数≥3次,经诊断确诊为URSA。②B超检查结果证实胚胎停止发育、无原始胎心搏动。③无家族遗传病史,夫妇双方染色体核型检查结果正常。④妇科检查、超声及子宫输卵管造影检查排除患者生殖器官畸形。⑤患者性激素、甲状腺功能、内分泌功能正常。⑥无生殖道感染。⑦临床资料完整,无精神障碍。排除标准：①流产原因明确,即因感染、染色体异常、解剖结构异常及自身免疫疾病等因素导致的流产。②生殖内分泌激素异常患者。③患者合并甲状腺疾病、糖尿病及自身免疫疾病。④合并恶性肿瘤。⑤近三个月服用过激素类药物。对照组纳入标准：①无不良妊娠史。②产前检查结果提示胎儿发育正常,血绒毛膜促性腺激素检查正常。

1.2 研究方法 通过查阅电子病历收集患者年龄、孕周孕酮水平等一般资料,入院后采集5 mL空腹静脉血,低温分离血浆,置-80 ℃冷冻保存。分别采集两组女性人工流产术后的新鲜绒毛,生理盐水常规冲洗,匀浆后取上清液待测,采用酶联免疫吸附法检测血清及绒毛组织上清液ADMA水平。Th17、Treg细胞采用美国Thrmo Fisher公司生产的流式细胞仪检测。白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-17、转化生长因子-β(TGF-β)采用ELISA试剂盒检测。收集的胎盘标本冰冻切片,HE染色后由同一病理科医师阅片。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,计数资料采用2检验,计量资料采用t检验,以表示,通过阈值效应分析孕妇与血浆及绒毛ADMA与URSA发生风险的关系,采用多因素Logistics回归模型分析发生URSA的独立危险因素,采用R软件构建列线图预测模型。检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 训练集患者年龄20～37岁,平均(27.52±2.94)岁,孕周6～12周,平均孕周(9.22±1.89)周。测试集患者年龄22～36岁,平均(27.84±2.67)岁,孕周6～11周,平均孕周(8.89±1.74)周,训练集和测试集患者一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组孕妇年龄23～36岁,平均(28.01±2.88)岁,孕周6～10周,平均孕周(8.56±1.68)周。与对照组比较,URSA组患者IL-6、IL-17、Th17及Th17/Treg显著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg显著降低(P<0.05),见表1。

表1 两组患者临床资料比较

2.2 两组患者外周血和绒毛组织ADMA表达 与对照组比较,URSA组血浆及绒毛组织ADMA表达均显著增加(P<0.05),见表2。

表2 两组患者外周血和绒毛组织ADMA表达

2.3 两组胎盘病理形态学改变 对照组绒毛发育良好,而胎盘光学显微镜下可见不同程度的绒毛发育不良,合体结节增多,并伴有微血栓形成,见图1。

图1 两组胎盘病理形态学改变

2.4 URSA发生的多因素分析 以表1中差异具有统计学意义的指标及血浆、绒毛组织ADMA表达为自变量,以是否发生URSA为因变量,进行多因素分析,结果显示IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血浆ADMA、绒毛组织ADMA是发生URSA的独立危险因素,而孕酮、IL-10、TGF-β及Treg是发生URSA的保护因素,见表3。

表3 多因素Logistic回归分析URSA发生的相关因素

2.5 血浆及绒毛ADMA与URSA的平滑曲线拟合 采用平滑曲线拟合血清血浆及绒毛ADMA与URSA的相关关系。在调整年龄、孕周等混杂因素后,采用广义相加模型和曲线拟合分析血浆及绒毛ADMA与URSA的关系,结果显示,血浆及绒毛ADMA与URSA呈线性正相关关系,随着二者水平的升高,孕妇发生URSA的风险增加,见图2。

图2 血浆及绒毛ADMA与URSA的平滑曲线拟合图

2.6 血浆及绒毛ADMA与URSA的阈值效应分析 调整受试者年龄、孕周等混杂因素后,当血浆ADMA≥1.43 μmol/L时,血浆ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加17%,差异具有统计学意义(OR=0.115,95%CI：0.102～0.133,P<0.05);当血浆ADMA<1.43 μmol/L时,差异无统计学意义(OR=1.080,95%CI：0.912～1.215,P>0.05)。当绒毛ADMA≥1.92 μmol/L时,绒毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加14%,差异具有统计学意义(OR=1.192,95%CI：1.085～1.302,P<0.05);当绒毛ADMA<1.92 μmol/L时,差异无统计学意义(OR=1.069,95%CI：0.926～1.118,P>0.05)。

2.7 模型构建 采用“rms”程序包,根据筛选出的9个独立影响因素建立预测孕妇发生URSA的列线图预测模型。结果显示,IL-6>190.45 nmol/L为35分,IL-17>916.25 nmol/L为15分,Treg<4.89%为30分,血浆ADMA>1.43 μmol/L为40分,IL-10<640.10 nmol/L为31分,TGF-β<2024.15 nmol/L为22.5分,Th17>2.62%为25分,绒毛ADMA>1.92 μmol/L为42.50分,Th17/Treg>0.56为20分,9项独立影响因素总分为 261分,对应孕妇发生URSA的风险值为0.890,即模型预测孕妇发生URSA的概率为89.00%,见图3。

图3 预测孕妇发生URSA的列线图预测模型

2.8 模型评价

2.8.1 ROC曲线评价模型区分度 采用ROC曲线对模型区分度进行评价,训练集AUC为0.758(95%CI：0.682～0.834,P<0.001);C-index为0.882。测试集AUC为0.732(95%CI：0.682～0.782,P<0.001);C-index为0.878。预测模型在训练集和测试集中的C-index均>0.75,模型区分度较高。见图4。

图4 预测模型在训练集和测试集中的ROC曲线

2.8.2 列线图模型校准度 评价绘制预测模型的校准曲线,结果显示模型的预测概率曲线与参考概率拟合度良好,Hosmer-Lemeshow检验结果差异无统计学意义(P>0.05),提示该模型准确度较高,见图5。

图5 预测模型在训练集和测试集中的校准曲线

2.8.3 列线图模型有效性评价 绘制临床决策曲线,结果显示,在训练集和测试集中模型均远离极端曲线,净获益高,提示构建的列线图模型安全可靠,实用性强。见图6。

图6 预测模型在训练集和测试集中的临床决策曲线分析

3 讨论

复发性流产是临床常见的妇科疾病,发生率约为1%～5%[9],随着妇女流产次数的增多,出现复发性流产的风险也逐渐增加。其病因复杂,目前的研究认为感染、遗传、及内分泌失调等均可能导致复发性流产[10-12],但仍有部分患者病因不明。研究表明,在妊娠早期胚胎生长环境相对缺氧,氧分压变化可影响绒毛血管生成,对胚胎的生长发育产生影响[13]。ADMA是L-精胺酸类似物,由Ⅰ型和Ⅱ型蛋白质精氨酸甲基转移酶催化后水解而来,最终通过二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylamine hydrolase,DDAH)代谢为L-瓜氨酸和二甲胺[14-15]。ADMA在细胞和组织中广泛存在,是一氧化氮合酶的抑制剂,通过抑制NO的合成参与血管内皮细胞功能障碍的生理和病理过程[16]。

健康孕妇孕早期血浆ADMA有所下降,随着妊娠时间的延长,血浆ADMA增加,而在孕晚期又降低至非孕期水平,究其机制,ADMA在孕早期水平降低可促进子宫螺旋动脉收缩,从而增强滋养细胞的迁移能力,增加胎盘血供,促进胎儿正常生长发育[17];而在孕晚期,ADMA水平增加,NO水平降低,从而提高子宫收缩功能,促进产妇分娩[18]。此外,NO也在维持胎儿宫内发育中发挥重要作用,可通过增加环鸟苷酸水平促进血管舒张,维持细胞及血浆转运系统稳定[19-20]。本研究显示,URSA患者URSA组血浆及绒毛组织ADMA表达均显著增加,通过选择性结合NOS抑制NO的形成,导致血管完整性受到破坏、胎盘血流灌注不良,蛋白质合成和细胞增殖受到抑制[21]。且本研究通过拟合曲线及阈值效应分析发现,血浆及绒毛ADMA与URSA呈线性正相关关系,随着二者水平的升高,孕妇发生URSA的风险增加,当血浆ADMA≥1.43 μmol/L时,血浆ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加17%,;当绒毛ADMA≥1.92 μmol/L时,绒毛ADMA每增加0.6 μmol/L,孕妇发生URSA的风险增加14%。

本研究发现,IL-6、IL-17、Th17、Th17/Treg及血浆ADMA、绒毛组织ADMA是发生URSA的独立危险因素,而IL-10、TGF-β及Treg是发生URSA的保护因素。研究表明,URSA患者外周血CD4+T淋巴细胞数量较健康孕妇明显增加,而Th17、Treg均属CD4+T亚群,其中Th17可可通过分泌IL-6、IL-17等炎性因子调节免疫功能,导致母儿发生免疫排斥反应,导致流产[22-23]。而Treg细胞则主要分泌IL-10、TGF-β等抑制性炎性细胞因子,可间接提高母体免疫耐受程度,促进胎儿生存[24]。在正常的生理状态下,Th17和Treg处于动态平衡,共同维持人体的免疫功能,而在URSA患者中,IL-6、IL-117、Th17及Th17/Treg较对照组显著增加,孕酮、IL-10、TGF-β及Treg较对照组显著降低,母体免疫反应呈现“Th17趋向”,增强母儿免疫排斥反应[25]。基于多因素回归分析结果,本研究构建了风险预测模型,通过对各独立影响因素进行量化评分,从而评估孕妇发生URSA的风险,ROC曲线、校准曲线及临床决策曲线评价结果显示该预测模型区分度、准确性较高,临床有效性较好,可为临床准确预URSA的发生提供指导。

本研究纳入的样本量较少且数据来自单一中心,增加了选择偏倚的风险,后续研究需扩大样本量进行多中心研究,以评估预测模型在不同环境及地域人群中的适用性。

4 结论

ADMA在URSA患者血浆及绒毛组织中的表达增加,是URSA发生的独立危险因素,对URSA的发生具有一定的预测价值。