杨德武 马福财 盖志刚 王铮 朱海宏

(1.青海大学研究生院,青海 西宁 810000;2.青海省人民医院普外科,青海 西宁 810000)

棘球蚴病是一种严重的人兽共患寄生虫病,由棘球蚴幼虫引起。目前研究表明,棘球蚴主要侵犯肝脏,并且在泡型包虫病(Alveolar Echinococcosis,AE)病例中,多首先发现于肝脏[1]。AE被公认为世界上最致命的慢性寄生虫病,严重威胁患者生命健康[2-5]。TGF-β/smad通路是导致肝纤维化的重要通路之一,在TGF-β亚分型中,TGF-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)能导致肝星状细胞转分化为肌成纤维细胞,经过一系列病理变化最终导致肝纤维化的发生[6]。α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)是一种高度收缩的蛋白质,由肌成纤维细胞分泌,在肝纤维化中具有标志性作用。有研究报道在糖尿病肾病模型中,Mfn2表达增高时,胶原4的表达降低,可抑制肾间质纤维化[7],研究进一步表明敲除Mfn2后,对小鼠的肝纤维化有促进作用[8]。也有研究表明肝纤维化组织中,miRNA-101的表达显著降低[9],由此可知Mfn2、miRNA-101在纤维化疾病进程中发挥重要作用。本课题旨在研究Mfn2、miRNA-101在肝泡型包虫病中的表达与纤维化以及与TGF-β1信号通路的关系,完善肝泡型包虫病导致肝纤维化的理论基础,希望能为肝泡型包虫病的治疗提供新的治疗途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2020年7月-2020年10月在青海省人民医院确诊的20例肝泡型包虫病患者作为研究对象,其中男性11例,女性9例,年龄20～50岁,均为青海藏族居民,均知情同意并签署知情同意书。本研究通过伦理委员会批准。纳入标准：①术前血清学包虫抗体阳性,肝脏CT及术后病理均诊断为肝泡型包虫病。②首次行肝泡型包虫病病灶根治术。③术前未发现远处脏器转移。④无肝炎、黄疸等慢性肝功能受损史。排除标准：①合并肝囊性包虫病及其它原因占位性疾病(寄生虫、良恶性肿瘤、肝脓肿等)。②有上腹部尤其是肝胆系统手术史及介入治疗史。

1.2 实验材料 Mfn2兔抗人Ι抗、TGF-β1兔抗人Ι抗、α-SMA兔抗人Ι抗、HRP标记的鼠二抗、HRP标记的兔二抗,RNAsimple总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成预混试剂、SuperReal彩色荧光定量预混试剂、miRcute miRNA提取分离试剂盒、miRcute增强型miRNAcDNA第一链合成试剂盒、miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒均购自于天根生化科技有限公司(北京),石蜡切片机,光学显微镜,罗氏LC480Ⅱ实时荧光定量PCR仪。

1.3 标本采集 各例患者术中取材,分为对照组A组(距病灶边缘2 cm以外的正常肝组织)、实验组B组(距病灶边缘2cm以内肝组织)。1份组织经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片(5片)后,分别行HE染色、Masson染色和免疫组化(dako试剂盒,两步法)。切片由资深病理专家读片,依据肝纤维化分期半定量评分系统METAVIR进行分级。免疫组化结果由两位病理医师采用盲法独立检测,在高倍镜(400×)下读片, 每张切片随机观察5个组织丰富的视野,按照阳性细胞所占百分比及细胞染色强度两评分相加,两位医师的检测数据结果取平均值综合判定,评定标准,见表1。3份组织放入液氮后转入-80℃冰箱保存,以备RT-qPCR使用。

表1 免疫组化计分判定标准

1.4 提取总RNA及miRNA 标本在液氮中充分研磨至粉末状态,取适量粉末标本放入无酶管中,按照RNAsimple 总RNA提取试剂盒及miRcute miRNA提取分离试剂盒说明书提取总RNA及miRNA。

1.5 反转录 Mfn2、TGF-β1、α-SMA体系由5×FastKing-RT SuperMix 4ul、TotalRNA 1.5 ul、RNase-Free ddH2O 14.5ul组成20ul体系,程序：42℃、15 min,95 ℃、3 min ;miRNA-101由miRNA 5ul、2×miRNA RT Reaction Buffer 10ul、miRNA RT Enzyme Mix 2ul、RNase-Free ddH2O 3ul组成20 ul体系,程序：42 ℃、60 min,95 ℃、3 min。

1.6 实时荧光定量法(RT-qPCR) Mfn2、TGF-β1、α-SMA引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司设计、合成,miRNA-101序列由天根生化科技有限责任公司引物库查询得到并由上海生工生物有限公司合成,GAPDH内参基因于生工生物工程(上海)股份有限公司购买,U6内参基因于天根生化科技有限责任公司购买。具体引物序列,见表2。反应体系20 uL,设立3个复孔。Mfn2、TGF-β1、α-SMA的RT-qPCR程序：预变性95 ℃ 15 min,然后95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s,40个循环;miRNA-101的RT-qPCR程序：预变性95 ℃ 15 min,然后94 ℃变性20 s、60 ℃退火/延伸34 s,45个循环。反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线。以GAPDH为内参照,计算目的基因Mfn2、TGF-β1、α-SMA的mRNA相对水平;以U6为内参照,计算目的基因miRNA-101的相对水平;计算结果用2-ΔΔCt表示。

表2 Mfn2、TGF-β1、α-SMA、GAPDH、miRNA-101、U6引物序列

2 结果

2.1 HE、Masson染色及免疫组化检测 依据HE、Masson染色,距病灶边缘2 cm以外基本为正常肝组织,距病灶边缘2 cm以内存在不同程度的纤维化,见图1、2。 Mfn2、TGF-β1、α-SMA免疫组化检测在肝组织内的表达呈黄色、棕黄色及棕褐色,见图3～5。

图1 肝组织HE染色(200×)

图2 肝组织Masson染色(200×)

图3 Mfn2在正常肝组织及肝纤维化组织中的表达(400×)

图4 TGF-β1在正常肝组织及肝纤维化组织中的表达(400×)

图5 α-SMA在正常肝组织及肝纤维化组织中的表达(400×)

2.2 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA表达量 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA在A、B组表达差异均有统计学意义(P<0.01);Mfn2蛋白和mRNA表达量在B组比A组显著降低(P<0.001);TGF-β1蛋白和mRNA表达量在B组比A组显著升高(P<0.001);α-SMA蛋白和mRNA表达量在B组比A组显著升高(P<0.001),见表3、4。

表3 正常肝组织及病灶旁组织中的Mfn2、TGF-β1和α-SMA蛋白表达结果

表4 正常肝组织及病灶旁组织中的Mfn2、TGF-β1和α-SMA的mRNA表达结果

2.3 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA在不同等级肝纤维化中的表达 Mfn2蛋白(r=-0.739,P<0.001)和mRNA(r=-0.652,P<0.001)的表达量与肝纤维化程度均成负相关,并且随着肝纤维化级别增加,Mfn2蛋白和mRNA的表达量逐渐降低;TGF-β1蛋白(r=0.790,P<0.001)和mRNA(r=0.867,P<0.001)的表达量与肝纤维化程度均成正相关,并且随着肝纤维化级别增加,TGF-β1蛋白和mRNA的表达量逐渐升高;α-SMA蛋白(r=0.882,P<0.001)和mRNA(r=0.758,P<0.001)的表达量与肝纤维化程度均成正相关,并且随着肝纤维化级别增加,α-SMA蛋白和mRNA的表达量逐渐升高。见表5、6。

表5 Mfn2、TGF-β1和α-SMA蛋白在不同等级纤维化中的表达

表6 Mfn2、TGF-β1和α-SMA的mRNA在不同等级纤维化中的表达

2.4 Mfn2、TGF-β1、α-SMA蛋白和mRNA表达量两两之间相关性 Mfn2蛋白与TGF-β1蛋白、α-SMA蛋白表达均呈显著性负相关(r=-0.768,P<0.001;r=-0.796,P<0.001),TGF-β1蛋白与α-SMA蛋白呈显著性正相关(r=0.844,P<0.001)。Mfn2 mRNA与TGF-β1 mRNA、α-SMA mRNA表达均呈负相关(r=-0.750,P<0.001;r=-0.622,P<0.01); TGF-β1 mRNA 与α-SMA mRNA表达呈正相关(r=0.753,P<0.001)。

2.5 miRNA-101在肝泡型包虫病中的表达 miRNA-101在A、B组的表达量差异具有统计学意义(P<0.001),miRNA-101在A组的表达量明显高于B组,随着肝纤维化程度加重,miRNA-101表达量逐渐减少,见图6。miRNA-101的表达量与Mfn2、TGF-β1、α-SMA的 mRNA表达量相关性分析： miRNA-101与TGF-β1 mRNA的表达呈负相关(r=-0.508,P<0.05);miRNA-101与α-SMA mRNA的表达呈负相关(r=-0.709,P<0.001);miRNA-101与Mfn2 mRNA的表达无显著相关性(r=0.402,P>0.05)。

图6 miRNA-101在正常肝组织、病灶旁组织以及不同等级纤维化中的表达

3 讨论

研究表明,肝纤维化的发展特点是细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积。ECM的过度产生会导致组织实质的破坏,进而导致肝脏结构框架的改变[10]。目前研究显示,肝星状细胞(HSC)的转分化、激活和增殖是促进肝纤维化进展的主要驱动力[11],病毒、寄生虫等导致肝细胞受损和免疫细胞浸润,激活HSC转分化成肌成纤维细胞。肌成纤维细胞通过合成和分泌胶原纤维促进肝脏细胞外基质的积累。肝泡型包虫病病灶旁组织出现局部纤维化改变,考虑与泡球蚴入侵肝脏后的增值和弥漫性浸润生长方式有关。泡球蚴感染入侵肝脏后以出芽和浸润式的方式增殖,会在肝脏形成很多囊泡,这些囊泡外壁角质层很薄,且与周围组织没有明显的纤维膜界限,并且在肝脏内长期存在,不断刺激周围肝组织,长期持续刺激使肝星状细胞活化转化成肌成纤维细胞,从而导致ECM的过度产生,导致肝纤维化。

TGF-β的多效性在肝脏疾病进展的几乎每个阶段都发挥着作用,且TGF-β为现知作用最强的促肝纤维化因子[12-13]。TGF-β1被认为是可使HSC激活的主要信号传导途径之一,和肝脏中最有效的纤维细胞因子[14-15]。四氯化碳或血吸虫病引起的中毒导致肝纤维化动物模型中TGF-β1水平升高,并且在肝纤维化患者中,也观察到TGF-β1 mRNA水平升高[16-17]。此外,α-SMA,被认为是肝纤维化的标记物,本研究发现,在肝泡型包虫病患者肝脏病灶旁组织局部肝纤维化中,TGF-β1、α-SMA的 mRNA和蛋白水平较正常肝组织明显升高,并且随着肝纤维化程度的增加,TGF-β1、α-SMA的 mRNA和蛋白表达水平也逐渐增加,并且TGF-β1与α-SMA相关性分析结果呈正相关,进一步证明了TGF-β1对肝纤维化有促进作用。

Mfn2在许多细胞过程中发挥着各种作用,包括细胞增殖和死亡[18-19]。有研究报道,在小鼠肝纤维化过程中,随着纤维化程度的进展,Mfn2表达量逐渐下降;高表达Mfn2后,小鼠肝纤维化进程得到一定缓解,并且很有可能是通过TGF-β/Smad通路起作用[20]。另有研究报道慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化,从而抑制肝纤维化[21]。本研究发现病灶旁纤维化组织中Mfn2的mRNA和蛋白表达量显著低于正常肝组织,随着纤维化程度的增加,Mfn2的mRNA和蛋白表达量逐渐降低,并且与TGF-β1、α-SMA分别行相关性分析,显示Mfn2与TGF-β1、α-SMA呈负相关,表明Mfn2可能通过抑制TGF-β1抑制肝泡型包虫病肝纤维化的进展。

miRNA是一种非编码单链小RNA,可调节纤维化疾病的生理和病理过程[22]。本研究中,miRNA-101在肝泡型包虫病病灶旁纤维化组织中的表达量显著低于正常肝组织,随着纤维化程度的增加,miRNA-101表达量逐渐降低,并且与TGF-β1、α-SMA分别行相关性分析,显示miRNA-101与TGF-β1、α-SMA呈负相关,提示miRNA-101可能通过抑制TGF-β1抑制肝泡型包虫病肝纤维化的进展。有研究报道一些miRNAs已被鉴定通过直接靶向Mfn2参与纤维化和平滑肌细胞增殖[23],但在本实验中miRNA-101与Mfn2行相关性分析,未发现显著相关。

4 结论

本研究表明,肝泡型包虫病病灶旁存在不同程度的局部肝纤维化,纤维化范围基本局限在病灶旁2 cm以内,病灶旁2 cm以外基本上是正常肝组织;在肝泡型包虫病肝纤维化中,进一步证明了TGF-β1对纤维化有促进作用;Mfn2、miRNA-101可能抑制肝泡型包虫病肝纤维化,并且可能通过抑制TGF-β1发挥抗纤维化作用。