王乙波 焦斌 王小强 陈歭行 曾慈梅

(海口市人民医院呼吸与危重症医学科 ,海南 海口 570000)

非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的80%,是肺癌的主要类型,且约3/4患者发现时已为中晚期,生存率较低[1-2]。研究NSCLC发展的分子机制,识别新的治疗靶点可助力NSCLC的治疗。成纤维细胞生长因子9(Fibroblast growth factor 9,FGF9)是一种生长因子,在血管生成、细胞凋亡等生理过程中发挥重要作用[3-4]。在胃癌、肝癌等恶性肿瘤中表达上调[5-6]。Liu等[7]研究显示,肺鳞癌中FGF9表达上调可促进细胞增殖与侵袭,但在临床中FGF9研究却较少。SMAD2是TGF-β信号传导通路中的重要分子,被TGF-β活化后转移至核内,参与对基因的调控,研究显示,SMAD2在NSCLC细胞中水平升高[8-9]。有关FGF9、SMAD2在NSCLC进展中发挥何种作用以及与预后的关系仍不确定。因此本研究将分析NSCLC组织中FGF9、SMAD2表达与临床病理以及预后的关系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集本院2018年1月-2020年12月期间的NSCLC患者临床资料75例,男性46例,女性29例,年龄30～75岁,平均(50.77±6.52)岁,鳞状细胞癌、腺癌、其他肺癌例数分别为33例、15例和27例;有无吸烟史患者分别为40例、35例;TNM分期I+II期、III期分别为48例、27例;高+中分化与低分化分别为48例、27例;发生淋巴结转移与未发生淋巴结转移分别为33例、42例。癌组织与癌旁组织标本分别称作NSCLC组、癌旁组织组。纳入标准：①经过X射线检查、CT及磁共振等影像学检查及手术病理确诊。②初次发现疾病。③患者知情同意。排除标准：①多脏器受损者。②手术前化疗者。③合并其他部位恶性肿瘤。本研究经本院伦理委员会审核、批准后实施(批号：20171121)。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学法检测NSCLC及癌旁组织中FGF9、SMAD2的表达 制备石蜡标本,常规脱蜡,并经抗原修复,室温条件下封闭,加入兔抗人FGF9、SMAD2一抗(1∶1 000稀释),4 ℃孵育过夜后加入山羊抗兔lgG H&L(1∶2 000稀释),37 ℃孵育1 h,DAB显色,苏木素复染,酸酒精短暂分化后,脱水、透明、封片。FGF9、SMAD2表达于细胞质,免疫组织化学结果判定采用半定量方法[10],最终评分<3分为阴性表达,≥3分为阳性表达。

1.2.2 NSCLC患者FGF9、SMAD2表达与临床病理的关系 根据NSCLC癌组织FGF9、SMAD2蛋白表达阴阳性将患者分别分为FGF9阴性表达组、FGF9阳性表达组,SMAD2阴性表达组、SMAD2阳性表达组,比较组间年龄、性别、吸烟史、组织类型、TNM分期、淋巴结转移及分化程度差异。

1.2.3 患者随访 多种方式(电话、微信等)随访NSCLC患者,随访时间最长为36个月,记录此间患者生存状态。无进展生存期(Progression-free survival,PFS)为随机化开始至第1次出现复发、转移或癌因死亡时间,总生存期(Overall survival,OS)为患者随机化开始至全因死亡的时间。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析,计数资料(FGF9阴阳性、SMAD2阴阳性)采用n(%)描述,组间比较采用χ2检验;Spearman法分析NSCLC癌组织FGF9、SMAD2表达相关性;K-M曲线分析NSCLC患者FGF9、SMAD2蛋白表达阴阳性与患者3年生存期的相关性;COX回归分析危险因素(NSCLC患者预后不良)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC组织及癌旁组织中蛋白FGF9、SMAD2的表达 FGF9、SMAD2阳性表达情况,见图1。与癌旁组织相比,NSCLC组织中FGF9表达阳性率、SMAD2表达阳性率升高(P<0.05)。见表1。

表1 NSCLC组织及癌旁组织中FGF9、SMAD2的表达[n,n(×10-2)]

图1 NSCLC组织及癌旁组织中FGF9、SMAD2的表达(免疫组化法,400×)

2.2 NSCLC组织中FGF9、SMAD2的表达与患者临床病理关系 NSCLC组织中FGF9阳性表达、阴性表达分别为53例、22例;SMAD2阳性表达、阴性表达分别为58例、17例。FGF9、SMAD2阳性表达、阴性表达与患者年龄、性别、吸烟史、组织类型无关(P>0.05);是否发生淋巴结转移、TNM I+II期与TNM III期NSCLC患者FGF9阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05);是否淋巴结转移、TNM I+II期与TNM III期、高+中分化与低分化NSCLC患者SMAD2阳性表达率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 FGF9、SMAD2的表达与NSCLC患者临床病理特征间的关系

2.3 NSCLC组织中蛋白FGF9、SMAD2的相关性分析 NSCLC组织中FGF9、SMAD2阴阳性表达正相关(r=0.281,P<0.05),见表3。

表3 NSCLC组织中FGF9、SMAD2蛋白的相关性分析

2.4 蛋白FGF9、SMAD2表达与NSCLC患者预后的关系 随访期间FGF9阳性表达组(死亡42例)患者累积生存率(20.8%)低于阴性表达组(死亡5例)(77.3%),组间比较差异有统计学意义(log rankχ2=22.243,P<0.05);SMAD2阳性表达组(死亡43例)患者累积生存率(25.9 %)低于阴性表达组(死亡4例)(76.5 %),组间比较差异有统计学意义(log rankχ2=13.791,P<0.05),见图2。术后随访期间FGF9阳性表达组(PFS 48例)患者无进展生存率(9.4 %)低于阴性表达组(PFS 8例)(63.6 %),组间比较差异有统计学意义(log rankχ2=34.045,P<0.05);SMAD2阳性表达组(PFS 49例)患者无进展生存率(15.5 %)低于阴性表达组(PFS 7例)(58.8 %),组间比较差异有统计学意义(log rankχ2=18.097,P<0.05),见图3。

图2 FGF9(左)、SMAD2(右)与NSCLC患者OS的关系

图3 FGF9(左)、SMAD2(右)与NSCLC患者PFS的关系

2.5 COX回归分析影响NSCLC患者预后的因素 单因素显示,年龄>50岁、有吸烟史、淋巴结转移、低分化、TNM分期III期、FGF9阳性表达、SMAD2阳性表达是影响NSCLC患者预后的危险因素(P<0.05);多因素COX分析表明,TNM分期III期、FGF9阳性表达、SMAD2阳性表达是NSCLC患者预后不良的危险因素(P<0.05),见表4。

表4 COX回归分析影响NSCLC患者预后的因素

3 讨论

NSCLC是肺癌中的最常见类型,其发生与多种基因的激活以及失活有关,针对它抑癌基因以及促癌基因进行研究,有助于NSCLC的分子靶向治疗。

FGF9是成纤维细胞生长因子家族成员之一,最初发现于人神经胶质瘤细胞系,是一种自分泌与旁分泌的生长因子,在人体组织与细胞中广泛存在,参与血管生成、骨骼发育、肿瘤生长与凋亡等多重生理病理进程[11-12]。FGF9在多种恶性肿瘤中发挥促癌基因作用,Ren等[13]研究显示,FGF9在胃癌组织中高表达,FGF9高表达是生存不良的预测因素,敲除FGF9表达可抑制胃癌细胞系生长并诱导细胞凋亡;Yin等[14]研究显示,FGF9影响肾肿瘤微环境与血管活性,抑制肾癌细胞的恶性转移。在肺癌中,FGF9刺激的成纤维细胞可能分泌了未知因子,激活了FGF受体2,随后促进了肺腺癌细胞的生长[15];FGF9可被miR-4317靶向抑制放缓NSCLC细胞的增殖[16]。本研究中NSCLC癌组织中FGF9表达阳性率显著高于癌旁组织,与其在肺癌细胞中的表达趋势一致,提示FGF9可能在NSCLC中发挥促癌作用参与NSCLC的癌发生。FGF9与性别、年龄、肿瘤类型、分化程度无关,发生淋巴结转移、TNM III期的NSCLC患者FGF9阳性率高于未发生淋巴结转移、I、II分期、中高分化患者,提示FGF9不受性别、年龄、肿瘤类型的影响,FGF9与NSCLC的癌进展高度相关,可能通过促进癌转移参与NSCLC的进展。研究发现,FGF9可与miRNA如miR-499a-5p、miR-187靶向结合,miR-499a-5p、miR-18的下调预示着NSCLC患者更差的预后[17-18]。在本研究中,NSCLC患者FGF9阳性表达组预后较阴性表达组差,且FGF9阳性表达是NSCLC预后不良的危险因素。提示FGF9与NSCLC患者预后有关,FGF9阳性表达可能预示着不良预后,需提高关注程度,这可能与FGF9能够激活MAPK通路,增强癌细胞增殖、EMT、细胞迁移和侵袭,并进一步促进癌转移有关[19]。但FGF9影响NSCLC进展的关键机制仍有待进一步分析探讨。

SMAD2是SMD家族成员之一,SMD介导多种信号通路的信号转导与转录,SMAD2介导TGF-β信号,从而调节细胞增殖、凋亡、分化等多种细胞过程,磷酸化的SMAD2可易位至细胞核,与靶启动子结合,发挥作用[20]。卢其香等[21]研究显示,肺癌组织与细胞中SMAD2 mRNA水平与蛋白表达上调,下调其表达可抑制肺癌细胞增殖、迁移能力;杨成等[22]研究显示,下调miR-423-5p可能通过抑制TGF-β/SMAD通路激活,抑制肺癌细胞脑转移;靶向抑制SMAD2表达可抑制肺腺癌A549细胞迁移与侵袭[23]。本研究中,NSCLC患者SMAD2阳性表达率高于癌旁组织,SMAD2阳性表达者中发生淋巴结转移、TNM III期、低分化者占比高于SMAD2阴性表达,且SMAD2阳性表达预后较SMAD2阴性表达差,提示SMAD2表达与NSCLC患者临床病理与预后相关,SMAD2阳性预示着较差预后,COX回归曲线也验证这一结果。Zeng等[24]报道称,SMAD2基因主要富集在肿瘤相关通路中,如TGF-β信号通路、Hippo信号通路和FoxO信号通路,SMAD2水平异常与NSCLC的预后相关,SMAD2可能是NSCLC的预后生物标志物和潜在靶点。本研究经过相关性分析显示FGF9与SMAD2正相关,提示FGF9与SMAD2可能通过某种联系共同参与NSCLC的癌进展。Sun等[25]研究显示,FGF9可通过调控TGF-β1/SMAD2/3信号通路抑制血管紧张素原诱导的心脏纤维化。本研究认为FGF9可能通过TGF-β影响SMAD2表达,共同参与NSCLC的癌进展,但相关机制需要细胞实验进行验证分析。目前本研究存在一定不足,FGF9、SMAD2参与NSCLC癌进展的机制有待进行细胞实验以及体内实验探讨。

4 结论

NSCLC组织FGF9、SMAD2阳性表达升高,均与患者临床病理特征以及预后相关,FGF9、SMAD2可能共同参与NSCLC的癌进展。