肖雪 梁妤婷 古锐 李莉 陈娟 钟家禹

1 广州天爱儿科专科门诊部，广州 510630；2 佛山南海天爱普通专科门诊部，佛山528299；3广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心，广州 510120

手足口病（hand， foot and mouth disease，HFMD）是肠道病毒（enterovirus，EV）引起的常见小儿急性传染病之一，多发生于5 岁以下的婴幼儿，临床症状以手掌、脚掌、口腔黏膜上发生水疱、发烧、呕吐为特征的一种病毒性皮肤病［1］。2008 年暴发时HFMD 病原主要以肠道病毒71 型（enterovirus 71，EV71）、柯萨奇病毒 A 组 16 型（Coxsaekievirus group A 16，CA16）为主要病原［2］，随后在2013 年前后HFMD 的病原谱逐渐发生改变，非EV71 非CA16 肠道病毒成为HFMD 的主要病原体［3-5］，其中以CA6 为HFMD 的主要流行病原体［6-7］。HFMD 从2008 年暴发以来，10多年来持续流行，也说明了HFMD的病原谱是在不断变化，需要长期监测与跟踪。

2020 年，新冠病毒突然暴发，改变了人们的生活方式，戴口罩，减少了传染病的流行。为了解新冠疫情期间及疫情后广佛地区的HFMD 病原感染情况，我们选取了新冠疫情期间及疫情后的两年进行对比，以分析广佛地区EV 的感染情况。

资料与方法

1.一般资料

2022 年1 月至2023 年8 月，采集到广州天爱儿科专科门诊部和佛山南海天爱普通专科门诊部就诊的疑似HFMD患者标本共659 份，其中2022 年362 份，2023 年1—8 月297份；标本大部份是咽拭子和肛拭子，小部份是疱疹液等。

2.方法

2.1.病原学荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测 2022 年1 月至2023 年8 月门诊收集659 份标本都外送到广州金域检测公司同时进行EV 通用型、EV71、CA16 荧光PCR 检测；检测试剂是金域公司的EV71、CA16 和EV 通用型三重荧光PCR 试剂盒，结果按说明书进行判断。

2.2.EV 型别5'非编码区（UTR）的引物设计与扩增 在对荧光PCR 检测结果为EV71 和CA16 病毒阴性而EV 通用型为阳性的标本，设计了UTR合成两对引物，引物参考之前的文章［8］，提取病毒RNA 进行RT-PCR，电泳片段符合预期大小的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，根据UTR基因核苷酸序列的同源性进行型别鉴定。

结果

1.2022年HFMD病原体检出情况

2020 年新冠病毒突然暴发后，EV 阳性率明显下降，2022 年同时进行EV 通用型、EV71、CA16 检测的标本有362份，总阳性47份，阳性率为12.98%，EV71全年没有检测到，CA16病毒阳性率为1.38%（5/362），CA16仅在4—7月份检测到，且检出率不高。非EV71非CA16的EV全年阳性率为11.60%（42/362）。全年检出率较高在5—7 月份，最高检出率在6月份，为22.22%。见表1。

2.2023年1—8月HFMD病原体检出情况

2023年是新冠病毒全国放开管控的第一年，EV 阳性明显增多，2023 年1—8 月同时进行EV 通用型、EV71、CA16 3种病毒检测的手足口病标本有297份，总阳性100份，阳性率为33.67%，1—8 月没有检出EV71，CA16 的检出率为2.36%（7/297），非EV71 非CA16 的EV 共检测出93 份，阳性率为31.31%（93/297），2023 年6、7 月份维持于较高的阳性率。2023年1—8月各月同时检测3种病毒情况见表1。

3.非EV71非CA16的EV型别扩增与分析

我们选取了荧光PCR检测结果中的EV71和CA16是阴性而EV 通用型为阳性的部份标本提取RNA，选取2022 年标本26份、2023年标本38份，提取RNA进行RT-PCR，对电泳片段符合预期大小的PCR产物送上海英骏生物技术有限公司测序，2022 年标本成功测序20 份，可分型为18 份，2023年成功测序31份，可分型为28份。序列用美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST 程序进行比较后，确定序列属于EV 型别，各序列属于病原谱如表2。在2022—2023 年中检出的非EV71 非CA16 的EV 有9 种，分别为：CA6、CA10、CA4、CA2、CA8、柯萨奇病毒B 组5 型（CB5）、CB2、CB3、埃可病毒30 型（E30）。其中CA6 在非EV71 非CA16 的EV 中占主要病原，检出率为27.45%，第二位是CA10，检出率为15.69%，这两种病毒占到非EV71 非CA16的EV的43.14%。各种型别的EV检出情况见表2。

讨论

HFMD 在我国从2008 年大规模暴发以来，连续多年在我国尤其是华南地区普遍流行，HFMD是一种对5岁以下儿童具有严重危害性的传染病，2008 年已将HFMD 纳入国家法定传染病丙类传染病。2020年，新冠病毒的突然暴发，导致管控措施的出现：如戴口罩、城市局部封闭，同时限制人口流动，改变了人们的生活方式，2022 年底才放开疫情管控。为了解新冠疫情期间及放开后广州地区的HFMD 病原感染情况，我们选取了新冠疫情期间及新冠疫情期放开后这段时间进行对比，分析广州和佛山地区手足口病的感染情况。

2022 年是新冠病毒暴发的第3 年，也是疫情管控的最后一年，2022年上半年广佛地区疫情管控相对较松的，下半年从国庆节后收紧直到11 月底放开，12 月份大规模感染新冠病毒，反映在HFMD 病原体流行特征为：上半年相对有流行，下半年流行明显下降。2022 年全年我们门诊HFMD 的总阳性检出率为12.98%（47/362），2022 年全年没有检出EV71，CA16 检出率也较低，仅在4—7 月有检出，在同时进行3 种病毒检测标本中，非EV71 非CA16 的EV，除12 月外全年11 个月都有检出，因为12 月是疫情放开的第一个月，很多人感染了新冠病毒，12月份没有检出EV，5—7月是EV检出较高的月份，其中全年最高检出率在6月份，为22.22%（8/36）。2023 年是新冠疫情放开的第一年，在1—4 月，EV的检出率不算高，而到了5 月份，EV 的检出率突然增加，到了8 月份又下降明显，2023 年1—8 月的检出率为33.67%，最高检出率为6月，为54.55%。2023年广佛地区的EV检出在5—7 月阳性率有一个突然上升的趋势，增加明显，而到8 月份又下降明显。2022 年的HFMD 流行特征与前两年我们收集的数据（2020、2021）有些不一样［9］，2022 年因为下半年的管控与放开，2022年下半年HFMD并没有明显的流行，与2020年上半年管控相似，而在2021年HFMD 还是存在两个明显的流行时期，到了2023 年，前4 月EV 并没有明显流行，可能是人们刚刚感染了新冠病毒，而到了5 月份后，EV感染突然开始上升，到了8月份又比7月份下降明显。新冠疫情结束后的2023 年比疫情期间的2022 年EV 阳性率高，今后的EV 感染趋势是否存在与2019 年之前那样存在夏秋两季流行，有待观察。

为了解2022—2023年EV 中除CA16、EV71外的具体哪些病毒流行，我们选取了荧光PCR 检测结果为EV71 和CA16 是阴性而EV 通用型为阳性的部份标本直接提取RNA，设计了EV 5'UTR 的引物进行PCR 扩增，之后进行测序及序列分析。2022—2023 年共选取了64 份标本进行PCR 扩增测序分析，有效分析了51 份序列，可以分型的有46 份，而5 份不能确定型别的，占9.80%，本次非EV71 非CA16 病毒确定了9 种病毒型别，这些型别存在于我们之前的统计数据中［8-9］，HFMD 经过10 多年的演变，感染型别趋于多样化［10］，这次我们分析的序列中分型的型别相对偏少，这可能与我们扩增的标本数量、分析的序列偏少有关。我们确定的型别中占主要的是肠道病毒A 组，为CA6、CA10、B5 等，其中CA6 和CA10 是最主要的两种病毒，这与国内别的地区流行趋势基本一致［11-13］，CA6 和CA10 已成为全球HFMD流行的主要病原［14-16］。

2022—2023年的检测标本中没有检测出EV71感染，这与我国多年来推行EV71 疫苗相关［17］，而CA16 感染率也是较低，非EV71非CA16的病毒占主要，这种感染状况在全国持续多年［3-4，18］，非EV71 非CA16 的EV 中存在较多型别，型别复杂，现在主要以CA6、CA10为主，CA6从2013年前后在我国开始流行［7，19］，现在已成为HFMD 的主要病原体，而近年来柯萨奇病毒B 组型别检出率也相对较高，其中以CB5 为多，同时埃可病毒型别也检出较多［13］，在我们测序中，有一定比例的非EV71 非CA16 的EV 难以定型，可能还有别的型别没有区分，这表明HFMD 感染型别较多，也侧面说明我国HFMD 这10 多年长期一直流行，可能与EV 型别多样化相关。因此，在监测EV71 和CA16 这两种主要型别EV 的同时，需要加强对非EV71 非CA16 的EV 的监测及分子流行病学研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明 肖雪：构建思路，论文写作，设计试验；梁妤婷、古锐：标本采集，数据收集，整理资料；李莉、陈娟：标本采集，实施试验，分析数据；钟家禹：审核论文，修改论文