刘芸 罗晓建，2 阮传清 徐庆贤

（1 福建省农业科学院农业生物资源研究所 福建福州 350003 2 福州理工学院 福建福州 350504 3 福建省农业科学院农产品加工研究所 福建福州 350003）

畜牧业已经成为我国农业经济生产中的支柱产业，畜牧业养殖过程中产生的污染已经引起广泛的关注［1］。畜禽粪便分解会产生氨气，这是畜禽养殖场恶臭的主要来源，超过一定量会损害人与畜禽健康。我国畜禽粪便已给生态环境造成了很大压力，其年产量于2000 年以后一直稳定在21.21 亿t 以上，为工业废弃物的2.7 倍［2］。畜禽粪便的处理方法主要分为化学法、物理法和微生物发酵法。相比较化学法和物理法，微生物发酵法简单、有效、成本低廉、可持续发展和资源化利用。但同时，畜禽粪便在微生物作用下产生的CH4、CO2和N2O 等气体会带来温室效应［3］。

微生物发酵床养殖技术利用稻壳、锯末、秸杆等作物废弃物做成发酵床，将动物放养在发酵床上。动物粪便排放于发酵床上，被垫料吸附、消解。这种养殖方法不需要建设沼气池、污水池和粪场，也无需冲洗畜禽舍，并降低了畜禽舍的NH3、H2S的排放量，是解决畜禽养殖污染的有效措施。微生物发酵床养殖技术在养猪业得到了广泛使用，衍化出原位发酵床和异位发酵床［4］。随着国家《畜禽规模养殖污染防治条例》和《水污染防治行动计划》的实施，发酵床在鸡、鸭养殖业的应用研究日益受到重视［5］。

优良的发酵床复合菌剂，能促进发酵床正常运行，降低NH3等臭气，减少病原菌，有利于动物的健康养殖。开发禽类发酵床复合菌剂有助于推广发酵床养殖技术，减少禽粪污染，保障养禽产业发展。发酵床上使用的菌种还存在适应性不广、南北效果差异大的问题［6］。本研究从发酵羊粪便中分离氨氮降解菌，通过室内活性比较筛选各类优良氨氮降解菌株，为进一步研发发酵床复合菌剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 样品来源与样品采集样品采集自福建省泉州市某养羊场发酵羊粪。将采集到的样品用实验冰袋冷冻保存，迅速带回实验室。

1.1.2 培养基及试剂

氨氮降解菌选择性培养基：葡萄糖5 g、硫酸铵2.5 g、氯化钠2 g、七水硫酸亚铁0.4 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、琼脂17 g，调节pH 值至7.2～7.4，加入蒸馏水至1 L，121 ℃灭菌20 min 后倒平板。

氨氮降解菌液体培养基：葡萄糖5 g、硫酸铵2.5 g、氯化钠2 g、七水硫酸亚铁0.4 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g，调节pH 值至7.2～7.4，加入蒸馏水至1 L，121 ℃灭菌20 min 后倒平板。

LB 液体培养基：胰蛋白酶10 g、酵母提取液5 g、氯化钠10 g，加入蒸馏水至1L，调节pH 值至7.4，121 ℃灭菌20 min。

Biospin 细菌基因组DNA 提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR 扩增试剂（上海生工生物工程服务有限公司）；16S rDNA 扩增引物（正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，上海生物工程有限公司）。

1.1.3 主要仪器与设备

ZHJH-C1209C 超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；Bluepard 隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪（德国耶拿分析仪器股份公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 氨氮降解菌菌株的筛选

将从试验基地采集回来的泉州羊粪样品中取5 g 装入到氨氮液体培养基中，之后将培养基放置到摇床上，30 ℃、180 r/min摇24～48 h。取10 mL 样品用90 mL 无菌水稀释10 倍，震荡均匀后在超净工作台中进行梯度稀释，得到浓度为10-1～10-5的稀释液，并将10-3、10-4、10-5稀释液分别涂布于与之对应的培养基的平板上，每种浓度涂布2 块平板，30 ℃条件下培养24～48 h。

记录涂布平板上生长出的全部菌落，依次将每种菌标记序号，并逐个进行挑取反复划线纯化培养。纯化后挑取出每一种菌落，用含有20%甘油（灭菌）的LB 液体培养基悬浮，放置于-72 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 菌株的分子鉴定

将划线纯化所得的单菌落进行提取DNA 与PCR 扩增。

16S rDNA 序列的PCR 扩增：取1.2.1 中纯化的培养物，采用Biospin 细菌基因组DNA 提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为PCR 扩增的模板，利用16S rDNA 引物进行PCR 扩增。

PCR 反应体系（25 μL）：ddH2O 18.7 μL、10×Taq Reaction Buffer 2.5 μL、dNTP（10 mmol/L each）0.5 μL、引物各1 μL、Taq DNA Polymerase 0.3 μL、Temple 1 μL。

PCR 扩增程序：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增结果，用凝胶图像分析系统观察并保存。

PCR 产物测序及序列对比分析：将扩增成功的PCR 产物送交福州铂尚生物技术有限公司测序。将测序结果通过网站GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列比对分析，选择相关的参考菌株序列，再经Clustal X［7］对齐后，用软件Mega 5.0［8］进行聚类分析（方法为Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor），构建分子系统发育树［9～11］。

1.2.3 氨氮降解菌脱氨效果检验

将之前放置于-72 ℃冰箱中保存备用的氨氮菌落取出，用氨氮降解菌选择性培养基进行划线纯化，培养48 h。之后将纯化好的菌株接种到氨氮液体培养基中，接种3 瓶培养基，并设立3 组添加无菌水的对照组，30 ℃、180 r/min 摇床培养48 h。然后将培养的菌液取5%重新接入新的氨氮液体培养基中，对照组也取5%重新接入新培养基中，继续做空白对照，30 ℃、180 r/min 摇床培养96 h，并在培养的过程中依据《水质 铵的测定 水杨酸分光光度法》（HJ 536—2009），检测并记录0、24、48、72、96 h 的液体培养基的氨氮含量，并计算氨氮降解率。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及分子鉴定结果分析

通过平板划线的方法从羊粪样品中共分离获得4 株菌株，编号分别为FJAT-56391、FJAT-56392、FJAT-56393 和FJAT-56394。

将4 种菌株样品测序结果通过网站GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）进行序列比对分析，菌株样品序列比对结果见表1，并以软件NJ 法（Neighbor-Joining，Nucleotide：Jukes-Cantor），构建系统发育树，结果见图1。从表1 和图1 中可以看出，芽孢杆菌属的占比最大，占全部菌株的50%。4 株氨氮筛选菌菌株序列相似度均＞99%。一般认为，16Sr DNA 序列同源性＞99%，可以认为同属［12］。

图1 菌株基于16S rDNA 序列构建的分子系统发育树

表1 同源菌株比对

2.2 氨氮降解菌脱氨效果检验

对筛选获得的4 株氨氮筛选菌株进行去除氨氮能力的检测，表2 是以氨氮（水杨酸）法检测每一种氨氮筛选菌每一天的氨氮剩余量及其范围的检测结果。如表2 所示，4 株菌株对氨氮均有一定的去除能力，FJAT-56394 在刚接入时的氨氮起始浓度为3.0 mg/L，72～96 h 后氨氮浓度变成0 mg/L；而FJAT-56391 在刚接入时的氨气的起始浓度为2.97 mg/L，范围±0.06 mg/L，96 h 过后氨氮的剩余浓度为2.56 mg/L，范围±0.07 mg/L，仅下降了约0.41 mg/L。所以各菌株对氨氮的去除效果有较大差异，其中有些菌株检测的剩余量相比于前一天呈断崖式减少或上涨。FJAT-56394 和FJAT-56392 这2 株除氨能力最强，降解率高达100%，而FJAT-56391 的除氨能力最弱，降解率为12%。

表2 氨氮降解菌脱氮效果

3 结论与讨论

本试验通过重复平板划线法纯化分离，从发酵羊粪中筛选到4 株降解氨氮的菌株，并通过16S rDNA 基因分子鉴定，菌株序列相似度均＞99%，其中芽孢杆菌属（Bacillus sp.）的菌株有2 株，数量占比50%。

通过氨氮水杨酸检测法检测液体培养基中氨氮的含量变化，验证4 株氨氮降解菌对氨氮的去除能力。4 株氨氮菌对氨氮均有一定的去除能力，可以为研制氨氮除臭菌剂提供优良的菌种资源，但各菌株对氨氮的去除效果有较大差异。在4 种氨氮降解菌株中，FJAT-56394 和FJAT-56392 这2 株除氨能力最强，降解率高达100%，而FJAT-56391 的除氨能力最弱，降解率仅为12%。