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核受体Nur77在结肠癌细胞奥利沙铂耐药中的作用及其机制研究

2024-01-10王迎梅王莹李超

中国肿瘤外科杂志 2023年6期
关键词:奥利结肠癌引物

王迎梅, 王莹, 李超

结肠癌为最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和肿瘤致死率分别位于恶性肿瘤发病率及致死率的第2位和第4位[1]。结肠癌多起病隐匿,约1/3的患者在发现时就已存在转移,而未发生转移的局限性结肠癌患者中约50%最终也会出现转移[2-3]。奥利沙铂作为结肠癌的重要化疗药物,极大改善了晚期结肠癌的治疗现状,提高了患者的生存质量,但耐药可影响其治疗效果,降低患者预后情况[4-5]。探索肿瘤靶向药物耐药性的生物学机制及其应对方案至关重要。近年来有研究学者指出,核受体Nur77可参与细胞的增殖、分化以及恶性肿瘤的发生及发展,且可能与结肠癌患者耐药密切相关[6-7]。鉴于此,笔者于本研究中探索了核受体Nur77在奥利沙铂细胞奥利沙铂耐药中的作用及其相关机制,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 主要材料与设备 结肠癌细胞SW480:美国Eppendorf公司;奥利沙铂(DMSO溶解后使用):江苏恒瑞医药股份有限公司;胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液、RIPA蛋白裂解液:美国Gbico公司;DMEM培养基、慢病毒载体、脂质体-2000:美国Invitrogen公司;PCR扩增系统:TaKaRa公司;引物设计及合成:上海信帆生物科技有限公司;兔NF-κB-p65多抗、兔NF-κB激酶复合体(IκB kinase complex,IKK)多抗、兔磷酸化IKK蛋白(p-IKK)多抗:英国Abcam公司;CO2恒温细胞培养箱:美国Healforce公司;4 ℃低温高速离心机:德国Beckman公司;酶标仪:美国Molecular Devices公司;聚丙烯酰胺电泳仪、转膜仪:美国BioRad公司。

1.2 细胞复苏、培养 从液氮罐中取出细胞,并迅速转移至37 ℃水浴箱中孵育至细胞冻存液完全融化后,800 rpm离心10 min离心10 min,弃掉上清液;在超净台上吸取细胞沉淀置于37 ℃含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM培养基内重悬,并用移液器将其吹打均匀后接种于含DMEM培养基的培养皿中,37 ℃、5% CO2培养箱中培养,隔天更换1次培养基;待细胞融合度达80%左右时,弃掉培养基,37 ℃的PBS清洗2次,加入37 ℃含EDTA的胰蛋白酶作用至光学显微镜下显示细胞折光性增强并出现明显细胞间隙后,加入10%胎牛血清终止消化、重悬混匀;按1∶3比例加入含10%胎牛血清DMEM培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养,隔天更换1次培养基。

1.3 Nur77载体构建及转染 严格按照PCR试剂盒说明书扩增Nur77及其Nur77抑制物引物,引物序列为Nur77上游5′-AATGAATTCGAATGCCCTGTATCCAAGCCCAA-3′,下游5′-AATGGATCCTCAGA-

AGGGCAGCGTGTCCATG-3′;Nur77抑制物上游5′-GACTTCATAAGAAGAGAGCATGCGCCTTGCGCATGC-3′,下游5′-AAGACTTCATAGAAGCAGGCGCATGCTCT-

TTATGAA-3′。扩增后予以KpnI以及BamHI双酶切纯化,并进行产物序列验证。在细胞融合度达80%的结肠癌细胞SW480培养皿中分别加入空载pcDNA3.1、Nur77载体及其Nur77抑制物载体与脂质体-2000的混合物(混合比例为1∶1,质粒DNA质量以0.8 μg为准,siRNA以2 nmol为准)进行转染;荧光检测转染成功后,将其置于正常培养基中继续培养,隔天更换1次培养基。

1.4 MTT法检测不同浓度奥利沙铂作用下细胞增殖情况 将正常结肠癌细胞SW480分为空白组与对照组、空载转染结肠癌细胞SW480设为空载组、Nur77载体转染结肠癌细胞SW480设为Nur77过表达组、Nur77抑制物载体转染结肠癌细胞SW480设为Nur77抑制组,取对数生长期各组结肠癌细胞SW480分别接种于96孔板中(每组设定5个复孔)培养24 h;分别加入含0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL奥利沙铂37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h后,加入20 μL MTT孵育4 h(空白组不加入奥利沙铂仅做增殖成活率对照使用)。酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)值,计算细胞相对增殖成活率及半数抑制浓度(IC50),增殖成活率(%)=(药物作用组OD值/空白组OD值)×100%。实验重复5次,取平均值。

1.5 Western blot法检测各组细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平 取各组对数生长期细胞,不同浓度奥利沙铂作用48 h后(方法同1.4),加入RIPA细胞裂解液冰浴15 min后,12 000 rpm离心15 min,提取细胞总蛋白;取蛋白上样行10%SDS-PAGE凝胶电泳分离、PVDF膜转膜、5%脱脂奶粉封闭2 h后,1∶500比例分别加入NF-κB-p65、IKK、p-IKK一抗4 ℃孵育过夜;PBS洗涤3次,加入二抗室温温育2 h;PBS洗涤3次,ECL化学发光显影,Image J图像分析软件检测蛋白条带灰度值。实验重复5次,取平均值。

1.6 qRT-PCR法检测各组细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表达水平 取各组对数生长期细胞,不同浓度奥利沙铂作用48 h后(方法同1.4),Trizol法提取总RNA;取少量mRNA,检测其在260 nm及280 nm波长的光密度(optical density,OD)值,若A260/A280值在1.8~2.0之间视为mRNA提取合格;按照qRT-PCR试剂盒说明书反转录合成互补DNA,内参采用GAPDH,结果使用公式F=2-△△Ct转换,NF-κB-p65引物序列为上游5′-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3′,下游5′-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3′;IKK引物序列为上游5′-CAAAGAACAGAGACCGCTGGTG-3′,下游5′-GCAGTGGCAAA-TCATTGGGTG-3′;p-IKK引物序列为上游5′-AGCTCTGGAACCTCCTGAAGA-3′,下游5′-AGCTCCAGTCTAGGGTCGTGA-3′;GAPDH引物序列上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,下游5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 Nur77对结肠癌细胞增殖活性及奥利沙铂敏感性的影响 随着奥利沙铂浓度的增加,结肠癌细胞SW480存活率逐渐降低,且尤以Nur77抑制组存活率最低(P<0.05),Nur77过表达组生存率最高P<0.05),详见表1。

表1 对照组、空载组、Nur77过表达组及Nur77抑制组细胞增殖活性及IC50值对比

2.2 Nur77对结肠癌细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平的影响 转染Nur77后的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平较其他各组细胞升高,差异有统计学意义(P<0.05),而转染Nur77抑制物的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平较其他各组细胞降低,差异有统计学意义(P<0.05),详见表2、图1。

图1 各组细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平条带图

表2 对照组、空载组、Nur77过表达组及Nur77抑制组细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白表达水平对比

2.3 Nur77对结肠癌细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表达水平的影响 转染Nur77后的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表达水平较其他各组细胞升高,差异有统计学意义(P<0.05),而转染Nur77抑制物的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表达水平较其他各组细胞降低(P<0.05),详见表3。

表3 对照组、空载组、Nur77过表达组及Nur77抑制组细胞NF-κB-p65、IKK、p-IKK mRNA表达水平对比

3 讨论

结肠癌发病率和死亡率正在以每年2.4%和1.3%的速度上升[8]。结肠癌发病早期并没有临床表现,发现时已出现远处转移[9]。流行病学研究显示,已发生远处转移的结肠癌患者对化疗的敏感性较差,5年生存率不足30%[10]。奥利沙铂作为第三代铂类化疗药物,以DNA为靶点,通过抑制铂原子与DNA形成交叉联结拮抗DNA的复制与转录,发挥其抗肿瘤生长的作用,在结肠癌的治疗中取得了较为显著的临床疗效[11-12]。然而临床研究证实,部分患者对此类药物耐药,耐药细胞易逃脱免疫系统的识别与攻击,患者的预后效果较差[13]。探索奥利沙铂等药物耐药性的生物学机制及其应对方案至关重要。

近年来部分研究证实,Nur77作为孤儿核受体家族成员之一,可通过调控细胞的增殖及凋亡过程而参与肿瘤细胞的发生及发展[14]。NF-κB作为可调控促凋亡和抗凋亡基因转录的因子之一,可与Rel家族成员RelA/p65等结合形成同源或异源二聚体,通过抑制DNA结合活性而参与肿瘤发生发展中的增生、转化、侵袭、药物与放射性抵抗等多种生理病理过程[15];NF-κB抑制剂可通过抑制NF-κB活性而提高抗肿瘤药物的敏感性,提高抗肿瘤效果[16]。结肠癌组织中NF-κB蛋白的表达水平升高,且结肠癌组织T分期越高,NF-κB蛋白表达水平越高,即NF-κB信号通路活性越高,肿瘤细胞侵袭性越强;降低NF-κB信号通路活性,可激活G蛋白偶联胆汁酸受体5(G protein-coupled bile acid receptor 5,TGR5)而抑制结肠癌细胞的增殖、迁移;抑制化疗耐受的异种肿瘤小鼠体内的NF-κB信号通路活性,可促使肿瘤细胞重新对化疗敏感[17-18]。另外部分研究证实,丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶超家族成员IKK磷酸化后,p-IKK参与了NF-κB-p65等的激活反应,机体在受到外界刺激后, TNF-α、活性氧中间介质等表达水平升高,IKK被激活,继而促使IκB蛋白磷酸化,识别DNA序列κB位点,参与转录的调节[19-20]。本研究结果显示,随着奥利沙铂浓度的增加,结肠癌细胞存活率逐渐降低,且尤以转染Nur77抑制物的Nur77抑制组结肠癌细胞存活率降低最,转染Nur77的Nur77过表达组结肠癌细胞生存率最高,且转染Nur77后的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白及其mRNA表达水平较其他各组细胞升高,而转染Nur77抑制物的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK蛋白及其mRNA表达水平较其他各组细胞降低。可见,Nur77的高表达可降低结肠癌细胞的药物敏感性,且通过增加IKK、p-IKK的表达水平,进而提高NF-κB信号通路活性可能是其促进肿瘤细胞增生、降低结肠癌细胞药物敏感性的主要作用机制;探索研究能够调节Nur77—NF-κB信号通路活性的相关医学干预手段对提高结肠癌患者的药物敏感性具有重要的临床意义,值得临床进一步深入研究探讨。

综上所述,随着奥利沙铂浓度的增加,结肠癌细胞存活率逐渐降低,但转染Nur77的结肠癌细胞存活率却异常升高,Nur77的高表达可降低结肠癌细胞的药物敏感性;且转染Nur77的结肠癌细胞内NF-κB-p65、IKK、p-IKK表达水平也随之升高,通过增加IKK、p-IKK的表达水平,进而提高NF-κB信号通路活性可能是其降低结肠癌细胞药物敏感性的主要作用机制。

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