毕莉斯，谢春祥，赵荣华，刘树民✉

（1. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江蟾宝生物科技发展有限公司，黑龙江 鹤岗 154100）

调查显示，80%的肺癌患者就诊时已是中晚期，其五年生存率不足14%［1］。大量研究表明，中医药在肺癌治疗中具有多方面的优势和作用，不仅可以对肿瘤进行有效的控制，还能改善患者的免疫功能和生活质量，减轻药物的毒副作用，提高治疗效果和患者的生存率［2-4］。

复方蟾酥胶囊由蟾酥粉、蟾皮、龟甲、三棱、莪术和黄芪组成，具有解毒消肿、止痛、开窍醒神功效。以蟾酥为君药进行组方，其中龟甲滋阴潜阳、退热除蒸、软坚散结，三棱和莪术破血行气、消积止痛，黄芪补气健脾、升阳举陷、益卫固表、利尿消肿、养血生津、行滞通痹、敛疮生肌、托毒排脓，具有抑制肺癌肿瘤生长、迁移及一定程度的抗化疗药物耐药的作用。因此，本实验以C57BL/6J小鼠Lewis肺癌模型，采用不同剂量复方蟾酥胶囊（低、中、高剂量，分别为标准剂量的0.5、1、2倍）进行治疗，采用ELISA 法、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹技术（Western blot）、HE染色检测小鼠肿瘤组织中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF mRNA表达、蛋白表达及肺组织病理情况，明确复方蟾酥胶囊对抑制肿瘤生长的作用。

1 材料

1.1 药物

复方蟾酥胶囊组成：蟾酥粉、蟾皮、龟甲、三棱、莪术和黄芪，由黑龙江蟾宝生物科技发展有限公司提供成方胶囊制剂，规格：0.35 g/粒，药方来源和药物含量暂属保密阶段。注射用顺铂粉（上海麦克林生化科技有限公司，批号：C14452924）。

1.2 动物

60 只SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2020-0001，鼠龄6～8 周，体质量（20 ± 2）g。均自由饮水及饮食，饲养环境温度（20 ± 2）℃，相对湿度45%～70%。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条例》要求，适应性喂养1周后进行后续实验。

1.3 细胞株

具有自发肺转移潜能的高转移小鼠Lewis 肺癌细胞株（LLC），移植率100%，购自赛百慷（上海）生物技术股份有限公司。

1.4 仪器

台式低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司，型号：SC-04）；倒置显微镜（日本东京OLYMPUS，型号：CKX3-SLP）；游标卡尺（上海美耐特实业有限公司，型号：MNT-150）；超净工作台（上海力申科学仪器有限公司，型号：BIOsafe12）；细胞计数板（哈尔滨菲诗科技有限公司，型号：C10228）；二氧化碳培养箱（上海力申科学仪器有限公司，型号：HF90）；酶标仪（TECAN，型号：AP1603）；电泳仪（美国BIO-RAD，型号：Mini-Protean）；转膜仪（美国BIO-RAD，型号：DYC-ZY2）；实 时 荧 光 定 量PCR（Themo Fisher Scientific，型号：Detecting System）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：ChemiScope 6200）；石蜡包埋机（德国Leica，型号：EG1160）；病理组织切片机（德国Leica，型号：HS-2205）。

1.5 试剂

优级胎牛血清（货号：BL201A）、DMEM 培养液（货号：BL304A）、胰酶细胞消化液（货号：BL512A）、青霉素-链霉素溶液（货号：BL505A）、1 × PBS 缓冲液（货号：BL302A）均北京兰杰柯科技有限公司。

小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA科研试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号：202305）；Toyal RNA提取试剂（TAKARA，批号：910819109）；反转录试剂盒（TAKARA，批号：RR047A）、2 × SYBR Green（Selleck，批号：B21702）；蛋白裂解液（货号：G2038-100 ML）、电泳液（货号：CR2105176）、电转液（货号：G2057-1L）（武汉塞维尔生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术有限公司，批号：P0010S）；Caspase-3 PIZ 兔抗（Selleck，批号：A5357），Anti-VEGF 兔抗（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：GB11034B），GAPDH兔抗（Selleck，批号：A5028），二抗羊抗兔IgG（H + L）-HRP（安诺伦生物科技有限公司，批号：BS13278）。

2 方法

2.1 模型小鼠的建立

复苏培养LLC 细胞，当细胞生长状态良好并处于对数生长期时收集细胞，使用PBS 稀释细胞至2 × 106个/mL，吸取细胞悬液后，于C57BL/6J 小鼠右腋皮下进行注射（0.2 mL/只）。模型小鼠接种成功后，1周内于小鼠右腋下可触及肿块。

2.2 分组及用药方法

10 只空白组不予处理；肿瘤体积大于50 mm3时将50只小鼠随机分为5组，每组10只。模型组灌胃生理盐水；复方蟾酥胶囊组根据人的使用剂量（2.1 g/70 kg），按照体表面积折算法进行人和小鼠等效剂量换算，将小鼠中剂量代替人临床剂量。经前期预实验研究探索，本研究将复方蟾酥胶囊用药量分别定为低剂量0.136 5 g/（kg·d）、中 剂量0.273 g/（kg·d）、高 剂量0.546 g/（kg·d），将胶囊内容物溶解于去离子水中灌胃给药，0.2 mL/只；顺铂组给予顺铂隔日腹腔注射给药，5 mg/（kg·d），0.2 mL/只。每日观察精神状态、活动度，隔2 日测体重、肿瘤体积及饮食饮水量，共给药14 d。第15天，脱颈处死所有小鼠剥取肿瘤及肺组织。

2.3 指标检测

2.3.1 肿瘤抑制率

给药14 d 后，各组小鼠脱颈处死，剥离肿瘤组织，称质量。

2.3.2 ELISA法检测TNF-α含量

按照1 mg 加入9 μL PBS 缓冲液的比例研磨肿瘤组织，提取上清液，根据ELISA 试剂盒说明书进行操作，在酶标仪中450 nm 处测定48 孔板各孔的OD 值，再计算TNF-α含量。

2.3.3 Real-time PCR 检 测 Caspase-3、VEGF mRNA的表达

使用Trizol 试剂提取肿瘤细胞的总RNA。提取后，对RNA 进行浓度测量，并进行配平以确保实验准确性。采用了荧光染料SYBR Green 进行实时荧光定量PCR 实验。PCR 反应体系总共为20 μL，其中包括10 μL的SYBR Green荧光染料，每个上下游引物（浓度为10 μmol/L）各1 μL，稀释后加入2 μL 的DNA 原液（初始浓度为2 μg），以及6 μL 的去离子水。PCR 反应条件设置如下：首先进行95 ℃的预变性步骤，时长为10 min；然后进行40 个循环的PCR 反应，每个循环包括95 ℃的变性步骤（15 s），60 ℃的退火步骤（30 s），以及72 ℃的扩增步骤（30 s）。在每个循环中同时读取荧光数值。实验完成后，进行熔解曲线分析。具体操作为：先进行一次95 ℃、15 s的变性步骤，并在60 ℃下保持1 min，然后从60 ℃至95 ℃，每增加0.5 ℃读取一次吸光值，最后再进行一次95 ℃、15 s 的变性步骤，并读取荧光数值。通过读取Ct值，可以计算出ΔCt值（Ct目的基因-Ct 内参GAPDH）、ΔΔCt 值（ΔΔCt 处理-ΔCt对照）和2-ΔΔCt值（相对表达量），并进行统计学分析。荧光定量PCR引物见表1。

表1 引物序列表

2.3.4 Western blot检测Caspase-3、VEGF蛋白表达

取出瘤组织称质量后放入玻璃匀浆器中，然后加入蛋白裂解液，将瘤组织样本加入10 μL 的蛋白裂解液进行操作。通过这一步骤，成功提取了肿瘤组织中的总蛋白。为了确定提取到的蛋白质浓度，使用BCA法进行浓度测定。随后，采用SDS-PAGE凝胶电泳技术对等量变性的蛋白样品进行分离。电泳过程中分别设置了80 V、30 min 和120 V、60 min 的电流条件，以确保蛋白质在凝胶中得到充分分离。完成电泳后，采用半干法将蛋白转移到膜上。然后使用含有5%脱脂奶粉的TBS/T 缓冲液对转膜后的膜进行洗涤处理，摇床1.5 h。最后，将稀释液稀释的兔抗小鼠Caspase-3 抗体（1∶1 000）和VEGF 抗体（1∶500）分别加入处理后的膜中，孵育，4 ℃封闭过夜，用TBS/T 洗涤4 次，再加入HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶10 000），摇床1 h，倒掉二抗，TBS/T 洗涤4 次，加入显影液于暗室中显影。胶片蛋白质条带用化学发光成像系统分析。ImageJ软件测定条带灰度值并进行统计分析。

2.3.5 HE染色观察各组肺组织病理变化

肺组织标本用生理盐水清洗后，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定，经脱水、包埋后制成石蜡切片，常规脱蜡、水洗，采用苏木素染色液浸染1.5 min后充分水洗，1%盐酸乙醇褪色20 s，自来水冲洗使切片恢复蓝色，伊红染色10 min，自来水冲洗30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡10 min，中性树胶封固，在20倍和200倍光学显微镜下观察肺组织的形态并拍照保存。

2.4 统计学方法

应用SPSS 22.0 和Graph Pad Prism 8.0 统计软件进行分析，计量资料以±s表示，数据符合正态分布及方差齐性后，应用归一化及单因素方差分析进行数据处理，P＜ 0.05表明差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠一般情况比较

造模成功后给药第4 天，模型组小鼠死亡1 只；给药第6 天复方蟾酥胶囊低剂量组死亡1 只；给药第11 天顺铂组死亡1 只、复方蟾酥胶囊低剂量组死亡2 只；给药第13 天复方蟾酥胶囊中、高剂量组各死亡1 只。小鼠死亡前精神状态差，全身颤抖，喘息样呼吸，停止进食和饮水。取材结束后每组取6 个样本进行实验指标检测。

3.2 各组小鼠瘤重和抑瘤率比较

与模型组比较，复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组瘤重均显著降低（P＜ 0.05），差异有统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠瘤重和抑瘤率比较

3.3 各组小鼠肺癌组织TNF-α水平比较

与模型组比较，复方蟾酥胶囊中、高剂量组及顺铂组能降低TNF-α 含量（P＜ 0.05），差异有统计学意义。见表3。

表3 各组小鼠肺癌组织TNF-α水平比较（±s）

表3 各组小鼠肺癌组织TNF-α水平比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

组别模型组顺铂组复方蟾酥胶囊低剂量组复方蟾酥胶囊中剂量组复方蟾酥胶囊高剂量组TNF-α/（ng/L）542.12 ± 21.67 358.20 ± 41.49**446.85 ± 108.37 369.34 ± 14.85*372.86 ± 31.21*n6 6 6 6 6

3.4 各组小鼠Caspase-3、VEGF mRNA 表达情况比较

与模型组比较，复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组能显著上调Caspase-3 mRNA 的表达（P＜ 0.05），显著下调VEGF mRNA 的表达（P＜ 0.05），差异有统计学意义。见表4。

表4 各组小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表达情况比较（±s）

表4 各组小鼠Caspase-3、VEGF mRNA表达情况比较（±s）

注：与模型组比较，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001，****P ＜ 0.000 1。

组别模型组顺铂组复方蟾酥胶囊低剂量组复方蟾酥胶囊中剂量组复方蟾酥胶囊高剂量组VEGF 1.00 ± 0.36 0.47 ± 0.08***1.17 ± 0.08 0.57 ± 0.15**0.99 ± 0.14 n 6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 ± 0.44 2.23 ± 0.30****0.76 ± 0.14 1.78 ± 0.16**1.06 ± 0.18

3.5 各组小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表达情况比较

与模型组比较，顺铂组Caspase-3 蛋白的表达显著增高（P＜ 0.05），复方蟾酥胶囊中剂量组Caspase-3蛋白的表达增高（P＜ 0.05）；复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组VEGF蛋白的表达显著降低（P＜ 0.05），复方蟾酥胶囊低、高剂量组VEGF 蛋白的表达降低（P＜0.05），差异有统计学意义。见表5、图1。

表5 各组小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表达情况比较（±s）

表5 各组小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表达情况比较（±s）

注：与模型组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001。

组别模型组顺铂组复方蟾酥胶囊低剂量组复方蟾酥胶囊中剂量组复方蟾酥胶囊高剂量组VEGF 1.00 0.47 ± 0.08***0.72 ± 0.20*0.55 ± 0.08**0.66 ± 0.09*n6 6 6 6 6 Caspase-3 1.00 1.94 ± 0.49**1.16 ± 0.28 1.79 ± 0.25*1.29 ± 0.23

图1 各组小鼠Caspase-3、VEGF蛋白表达电泳图

3.6 各组小鼠肺组织HE染色结果

空白组小鼠肺脏组织无明显异常，未见明显的炎性改变。模型组肺组织中多见肺泡壁增厚，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部支气管可见上皮细胞坏死，核碎裂，有明显肺水肿及出血。顺铂组及复方蟾酥胶囊中剂量组肺组织中可见肺泡壁上有弥散的淋巴细胞与中性粒细胞浸润，局部可见大量支气管上皮细胞增生，可见较大量的肺泡腔扩张，肺水肿和出血情况大为减轻，肺泡腔内有嗜酸性浆液样物质渗出。复方蟾酥胶囊低、高剂量组肺组织中可见较多肺泡壁增厚，伴有弥散的淋巴细胞与中性粒细胞浸润，多见肺泡腔扩张；少见支气管上皮细胞坏死，核碎裂；局部组织边缘可见肺水肿，肺泡腔内有嗜酸性浆液样物质渗出，周围有较多水肿液及红细胞，但较模型组少。见图2。

图2 小鼠肺组织HE染色结果

4 讨论

肺癌是最复杂的疾病之一，其潜在机制尚不清楚。近年来中医药在肺癌的防治中发挥了很大作用，因此，进一步探究中药复方抑制肺癌生长、转移及作用机制意义重大。

蟾酥具有确切的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖、促进肿瘤细胞的分化、诱导肿瘤细胞的凋亡，还有逆转耐药性、抑制肿瘤血管形成、抑制肿瘤细胞侵袭转移、阻滞细胞周期及增强免疫的作用［5］。炎症反应贯穿于肿瘤疾病的始终，TNF-α的增多能够增强肿瘤免疫活性，促进肿瘤细胞生长和迁移［6］。Caspase-3通过切割重要的细胞底物来执行凋亡的下游执行步骤，诱导肿瘤细胞凋亡，并导致细胞自噬死亡［7-9］。有实验证明VEGF 可以促进血管活性分子产生，调节血管张力，免疫抑制肿瘤微环境，促进淋巴内皮细胞生长和导致肿瘤细胞凋亡［10-14］。

本研究的复方蟾酥胶囊以蟾酥为君药进行组方，研究结果显示，受药物浓度增加药物溶解度降低及蟾酥毒性增强影响，高剂量组药效低于中剂量组；与模型组比较，复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组瘤质量显著降低，能有效的抑制Lewis 肺癌肿瘤的生长。采用ELISA 法、PCR 与Western blot 检测瘤组织中TNF-α含量，Caspase-3、VEGF 的表达，均显示复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组能降低TNF-α 含量，显著上调Caspase-3 mRNA 及蛋白的表达，显著下调VEGF mRNA及蛋白的表达。肺组织HE结果显示，与模型组比较，复方蟾酥胶囊中剂量组及顺铂组局部支气管可见上皮细胞增生，肺泡腔内有嗜酸性浆液样物质渗出。由此可见，复方蟾酥胶囊可以有效抑制Lewis肺癌的生长与转移，可能与上调Caspase-3的水平，下调TNFα、VEGF的表达有关。