冯时茵，曲新艳，饶秋红，戚扬，廖小红，丘振文，陈斌

1. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405 2. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，山东 济南 250014

溃疡性结肠炎（UC）是常见消化系统疑难病，病理变化呈慢性炎症反应，可累及直肠、结肠，具体病因尚未明确，一般认为与多种遗传及环境因素关系密切，临床以反复发作、病情迁延为特点[1]。西医针对UC 主要以药物治疗为主，一线药物主要包括氨基水杨酸类、皮质类固醇、免疫抑制剂等。其中氨基水杨酸类药物的缓解率约为50%，可缓解轻、中度活动期UC 患者症状；而皮质类固醇和免疫抑制剂治疗存在服药周期长、毒副作用大、病情易复发、诊疗费用高等诸多不足，使临床治疗受到极大限制[2-3]。因此，寻找安全有效、副作用小的UC 治疗方案迫在眉睫。近年来有研究表明，中医药治疗UC 疗效明确，能有效预防复发，且副作用少[4-7]。临床上以四神丸加减方治疗脾肾阳虚型UC 疗效显著，但具体治疗机制尚不明确。本研究采用葡聚糖硫酸钠（DSS）构建小鼠UC 模型，探讨四神丸加减方治疗UC 的疗效机制。结果报道如下。

1 材料与仪器

1.1 实验动物健康雌性C57BL/6 小鼠，SPF 级，7～8 周，共30 只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2021-0011。

1.2 主要试剂及仪器DSS 购自MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪肠溶片（Losan Pharma GmbH 公司，国药准字号H20171358，规格：500 mg/粒）；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（Thermo Fisher Scientific）；Toll 样受体4（TLR4）、p65 分子量、磷酸化P65（pp65）和β-actin 抗体购于Cell Signaling Technology公司。

2 研究方法

2.1 造模方法以7～8 周龄雌性C57BL/6 小鼠为实验对象，在适应性喂养7 d 后，小鼠自由饮用无菌水配置的2.5% DSS 溶液，连续7 d（每3 d 更换DSS 溶液1 次）[8]。

2.2 药液制备四神丸加减处方：黄芪、白术各20 g，补骨脂、肉豆蔻、土茯苓各15 g，五味子、乌梅、淡附子、川芎、当归、麸炒枳壳各10 g，黄连6 g，吴茱萸5 g。取中药饮片总质量的10 倍水浸泡药材60 min，大火煮沸后改为文火保持沸腾状态煮50 min，滤取煎液，然后再加中药饮片总量的8 倍量水，大火煮沸后改为文火保持沸腾状态煮30 min，滤取煎液，合并2 次煎液，并将其加热浓缩至含生药2 g/mL的药液，冷却后于4 ℃储存，使用时按照各组给药剂量进行稀释。

2.3 给药方法将30 只小鼠随机分为正常组、模型组、阳性对照组、四神丸加减方高剂量组（简称高剂量组）和四神丸加减方低剂量组（简称低剂量组）各6 只，阳性对照组以美沙拉嗪肠溶片按照400 mg/kg剂量灌胃，四神丸加减方2 个剂量组分别按照400、200 mg/kg 剂量灌胃，正常组和模型组予等体积无菌水灌胃，均给药7 d。其中，模型组、阳性对照组、高剂量组和低剂量组都给予2.5%的DSS 进行造模，正常组小鼠饮用常规饮用水。

3 观察指标与统计学方法

3.1 观察指标①小鼠疾病活动指数（DAI）。自造模第1 天起，每天观察小鼠精神状态并称重；在实验结束后根据体质量、大便性状、大便隐血/肉眼血便的评分（评分标准见表1）计算DAI，DAI=体质量下降评分+粪便黏稠度评分+便血评分。②小鼠结肠长度。实验结束后，收集各组小鼠结肠组织并对其长度进行测量记录。③结肠组织病理学变化。实验结束后，截取小鼠近端结肠，于4%中性甲醛溶液中固定24 h 以上，用石蜡包埋，切成5 μm 的连续切片，然后进行脱蜡处理，再进行苏木精-伊红染色法（HE）染色，显微镜下观察小鼠结肠组织病理变化情况。④结肠组织炎症因子表达。收集各组小鼠结肠组织，并将结肠组织和磷酸盐缓冲液按照1∶20 的比例进行研磨、离心，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测结肠组织研磨液中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）的表达水平。⑤结肠组织中TLR4、p65 和p-p65、β-actin 蛋白表达。提取各组小鼠结肠总蛋白，进行蛋白定量和变性后，按照每孔30 μg 的标准上样，之后进行电泳和转膜，分别孵育一抗和二抗，显色后将载有目的蛋白的聚偏二氟乙烯膜置于化学发光系统中，检测TLR4、p65 和p-p65 等蛋白表达水平，以β-actin 作为内参蛋白。

表1 小鼠体质量下降、大便性状和便血评分标准

3.2 统计学方法所有数据采用GraphPad Prism 软件进行处理。计量资料符合正态分布者采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差。P＜0.05 为差异有统计学意义。

4 研究结果

4.1 5 组小鼠DAI 评分比较见表2。实验结束后，模型组小鼠DAI 评分较正常组显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和高剂量组小鼠DAI 评分结果均显著下降（P＜0.05），而低剂量组小鼠DAI 评分无明显变化（P＞0.05）。

表2 5 组小鼠DAI 评分比较（±s）分

表2 5 组小鼠DAI 评分比较（±s）分

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

DAI 0.0±0.0 9.9±0.7①7.1±0.9②6.7±2.1②9.4±1.9组 别正常组模型组阳性对照组高剂量组低剂量组鼠数66666

4.2 5 组小鼠UC 严重程度比较见表3。实验结束后，模型组小鼠结肠长度较正常组缩短（P＜0.05）、粪便黏稠度及便血评分升高（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组小鼠结肠长度明显增加（P＜0.05），而阳性对照组、低剂量组小鼠结肠长度略有增加，但差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组及高、低剂量组小鼠粪便黏稠度评分均明显降低（P＜0.05）；阳性对照组及高、低剂量组小鼠便血评分无明显变化（P＞0.05）。

表3 5 组小鼠UC 严重程度比较（±s）

表3 5 组小鼠UC 严重程度比较（±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

便血评分（分）0.0±0.0 2.1±0.4①1.9±0.7 2.0±0.6 2.9±0.4组 别正常组模型组阳性对照组高剂量组低剂量组鼠数66666结肠长度（cm）7.0±0.5 5.1±0.5①5.4±0.4 6.0±0.8②5.2±0.7粪便黏稠度评分（分）0.0±0.0 4.0±0.0①2.0±0.0②2.4±0.5②3.0±1.0②

4.3 5 组小鼠结肠组织病理结果比较见图1。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中杯状细胞明显减少，隐窝结构损伤严重，出现明显的炎症浸润。与模型组比较，阳性对照组、高剂量组小鼠结肠组织中杯状细胞增多，隐窝结构损伤减少，炎症浸润程度明显改善；而低剂量组上述病理变化略有改善。

4.4 5 组结肠组织中IL-6、IL-10 表达水平比较见表4。实验结束后，模型组小鼠结肠组织中IL-6水平较正常组显著升高（P＜0.05），IL-10 水平较正常组显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组IL-6 水平显著降低（P＜0.05），阳性对照组及低剂量组IL-6 水平下降不明显（P＞0.05）；高、低剂量组IL-10 水平显著升高（P＜0.05），阳性对照组IL-10水平升高不明显（P＞0.05）。

表4 各组小鼠结肠组织IL-6、IL-10 水平比较（±s） pg/mL

表4 各组小鼠结肠组织IL-6、IL-10 水平比较（±s） pg/mL

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

IL-10 50 242.0±7 227.0 5 645.0±1 583.0①8 078.0±1 774.0 22 267.0±6 792.0②14 275.0±2 731.0②组 别正常组模型组阳性对照组高剂量组低剂量组鼠数66666 IL-6 2 227.0±587.7 10 439.0±2 817.0①7 215.0±2 261.0 3 120.0±879.6②9 791.0±3 295.0

4.5 5 组结肠组织TLR4、p65 和p-p65 蛋白表达水平比较见图2、表5。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中TLR4、p65 和p-p65 表达水平明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组及高、低剂量组小鼠结肠组织中TLR4、p65 和p-p65 的表达水平均明显降低（P＜0.05）。

图2 5 组结肠组织TLR4、p65、p-p65、β-actin 蛋白表达

表5 5 组小鼠结肠组织TLR4、p65、p-p65蛋白相对表达水平比较（±s）

表5 5 组小鼠结肠组织TLR4、p65、p-p65蛋白相对表达水平比较（±s）

注：①与正常组比较，P＜0.05；②与模型组比较，P＜0.05

p-p65 0.3±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.9±0.0②0.9±0.0②组 别正常组模型组阳性对照组高剂量组低剂量组鼠数66666 TLR4 0.4±0.0 1.0±0.0①0.9±0.0②0.8±0.0②0.7±0.0②p65 0.6±0.0 1.4±0.0①1.1±0.0②0.9±0.0②1.0±0.4②

5 讨论

UC 是一种原因尚不完全明确的慢性非特异性大肠炎症性疾病，病变主要限于直肠和结肠的黏膜层及黏膜下层，通常以腹痛腹泻、脓血便、里急后重为主要临床症状，该病病程绵延难愈，易反复发作，对患者的生活质量造成了严重影响。近年来，我国UC 发病率明显增高，其中北方地区发病率为1.64/10 万，南方地区发病率为2.05/10 万[9-10]。现代医学一般采用口服氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物治疗UC，如病灶在结肠远端可给予保留灌肠或者肛门给药的方式，使药物在肠道内长时间缓慢吸收。在药物治疗效果不佳且出现肠道穿孔、出血、恶变等情况下可以考虑外科治疗，但也无法完全控制病情发展，故UC 已被世界卫生组织列为当代难治性疾病之一。

中医学古籍中并无UC 对应的病名，按其症状表现可归属于中医学肠澼、便血、肠风下血、痢疾、泄泻、滞下、腹痛、脏毒、久痢等范畴。中医学认为，此病与劳逸不当、外感时邪、湿热内蕴、七情内伤、饮食不节等多种因素有关，多由于饮食不节、情志内伤、劳倦过度、脾肾阳虚、感受湿邪等所致[11]。而脾肾阳虚是UC 常见证型之一，主要是因为病程漫长、反复难愈，脾气不升、中气下陷，损伤脾阳，累及肾阳，最终导致脾肾阳虚。UC 为本虚标实之证，其中活动期以标实为主，多为湿热血瘀；缓解期以本虚为主，多表现为脾阳虚，也有兼肾阳不足的情况。笔者通过对相关的文献梳理与数据统计分析，分析古今医家对UC 病因病机的理论认识，结合广州中医药大学第一附属医院脾胃病名家经验[12-13]，同时通过综合专家经验辨证，提取证候要素，总结该病常见证候及证候要素分布的特点[14-15]，皆发现脾肾阳虚证为慢性UC 的重要证型。四神丸是中医治疗脾肾阳虚型泄泻的代表方剂，故本研究选用四神丸加减方作为观察方剂进行研究。

四神丸加减方方中补骨脂补肾壮阳，温脾止泻；肉豆蔻温中涩肠，主虚泻冷痢；吴茱萸温中助阳，专治脏寒泄泻。三者为君药，共奏温脾肾阳、涩肠止泻之功。五味子、乌梅皆性酸，五味子收敛固涩，乌梅收涩止痢；附子振奋肾阳，温暖脾土；三者共为臣药，以助君药温阳收涩。黄芪、白术益气扶正，利水除湿；川芎、当归行气活血；土茯苓解毒祛湿，黄连解毒清热，六者佐治兼证，有益气活血、解毒清热、除湿止泻之功。炒枳壳行气导滞，调和诸药，为使药。本研究所用加减方在四神丸温肾散寒的基础上加入涩肠止泻、益气活血、清热利湿解毒之品组成，寒温并用，共奏祛邪扶正、气血双调、涩肠止痢之功。

本研究采用DSS 构建小鼠UC 模型，评估四神丸加减方缓解UC 的效果及其机制。研究发现，高剂量组小鼠DAI 均显著下降；高剂量组能显著减轻小鼠结肠长度缩短及腹泻情况，低剂量组也可改善小鼠腹泻情况。杯状细胞减少、隐窝结构丧失和炎性细胞浸润增加是DSS 引起的结肠损伤结果[16]，本研究结果显示，高剂量组可明显改善小鼠结肠组织的杯状细胞减少、隐窝结构损伤及炎症浸润情况；低剂量组对小鼠结肠组织的腺体损伤的炎症浸润情况稍有改善。作为肠道炎症的重要指标，促炎细胞因子IL-6 在UC 诱导后显著增加，而IL-10 在抑制肠道炎症中发挥重要作用[17-18]。本研究结果显示，高剂量组小鼠结肠组织中IL-6 表达水平出现显著下降，而高、低剂量组均可明显提高小鼠结肠组织中的IL-10的表达水平。

TLR4/NF-κB 信号通路的激活可增加促炎细胞因子的表达，在炎症反应过程中具有重要作用。作为TLR4/NF-κB 信号通路的效应蛋白，正常情况下p65和p52 蛋白、IκB 在胞质中形成稳定的复合体，TLR4 被配体激活后，其胞内结构域招募MyD88，磷酸化IκB 激酶（IKK），磷酸化的IKK 进一步激活IκB，激活后的IκB 会释放复合体中的p65 并将其磷酸化，磷酸化后p65 进入细胞核发挥转录作用。同时，IκB 也可以进入细胞核，竞争性抑制p-p65 的转录活性，所以细胞中p65 的增多可以在胞质中与IκB结合，减少IκB 的入核，同时可以生成更多的p-p65进入细胞核，发挥转录活性，加剧炎症反应[19]。而本实验结果显示，高剂量组小鼠结肠组织中TLR4、p65 和p-p65 表达水平均降低，从而减轻机体炎症反应。以上研究不仅揭示了四神丸加减方的疗效及其作用机制，也为阐释中医药疗效内涵提供有益借鉴。