马红玉,翟洪稳,张明星,任晓伟,王 敬,黄建辉

(河北省食品安全重点实验室,国家市场监管重点实验室(特殊食品监管技术),特殊食品安全与健康河北省工程研究中心,河北省食品检验研究院,河北 石家庄 050227)

0 引言

米粉是一种以大米为主要原料的婴幼儿谷物辅助食品,为适于婴幼儿的各种营养需要,需要添加适量的营养强化剂。因其受众人群是婴幼儿,所以保证其质量与安全是监督监管的重点[1]。针对婴幼儿谷类辅助食品,国内外都发表了相关研究以及标准[2-5]。我国在2010年发布了 GB 10769—2010《食品安全国家标准婴幼儿谷类辅助食品》,规定了米粉中各类营养成分、含量指标以及具体检验方法[6]。维生素E 是其中可选择的营养成分之一。维生素E又叫生育酚,是一类具有生物活性的酚类物质,包含α、β、γ和δ-维生素E 4种同分异构体,是机体所必需的脂溶性维生素之一[7,8]。维生素E具有抗氧化、抗不育、调节免疫力等作用[9-10]。维生素E虽是必需营养素,但婴幼儿食物来源单一,添加量会直接影响其健康。自1922年发现维生素E以来,科学家们对其进行了大量研究,其中对α-维生素E研究居多。然而其它三种维生素E具有独特的生物学特性,对人体健康有益,因此开发建立其分析分离方法很有必要。

维生素E性质不稳定,一般不直接加入到米粉中,在需要营养元素强化时,一般加入维生素E 醋酸酯或者维生素E棕榈酸酯[11]。目前,米粉中维生素E的检测方法主要采用反相色谱法[11-14],液质联用法[15]。米粉基质中含有淀粉,在测定维生素E时,需酶解,高温皂化,液液萃取,最后旋转蒸发等操作将维生素E溶解于甲醇溶液中,才能使用反向色谱法进行定性定量分析[16]。该方法采用液液萃取,前处理过程繁杂,容易造成目标物的降解和损失,影响结果准确性。因此,提高前处理提取净化效率,对于维生素E的准确测定尤为重要。除了开发新的准确高效样品制备方法外,还有一种提高分析效率和准确性的方法,即将样品制备技术与后续的检测技术在线耦合。与离线样品制备过程相比,在线净化方法利用固相萃取取代液液萃取,不仅降低实验试剂的消耗,而且提高了检测准确性。近年来,在线净化技术不断发展,在食品检测领域应用广泛[17,18]。

本文建立在线固相萃取-液相色谱法测定米粉中维生素E的新方法[19]。米粉样品经酶解、皂化处理后,直接经在线固相萃取柱净化,然后经过六通阀进入液相色谱仪进行分析测定。整个过程简单,省去了液液萃取、旋转蒸发以及甲醇复溶等步骤,操作简单便捷,避免了繁琐操作造成的实验误差,且缩短了检测时间,提高了检测效率,减少了有机溶剂的使用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品:α-维生素E(SUPELCO公司)、β-维生素E(SUPELCO公司)、δ-维生素E(SUPELCO公司)、γ-维生素E(SUPELCO公司)。

α-淀粉酶(10万U/g)、L-抗坏血酸(分析纯);氢氧化钾(KOH)(分析纯)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)(分析纯);甲醇(色谱纯)、无水乙醇(色谱纯)、甲基叔丁基醚(色谱纯)、乙腈(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

HPLC系统(1260Aglient,配有紫外检测器、两个四元泵);紫外可见分光光度计(UV-2600,Shimadzu);电子天平(美国梅特勒托利多公司);离心机(德国SIGMA公司);Milli-Q纯水(德国Merck公司);涡旋混匀器(德国海道夫公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 标准品配制

α、β、γ、δ-维生素E标准储备液(1.0 mg/mL)临用前进行校正(参照GB 5009.82—2016附录B)。取上述校准后标准溶液适量,用50%乙醇水溶液(V/V)稀释成浓度分别为1 μg/mL,2 μg/mL,5 μg/mL,10 μg/mL,20 μg/mL,50 μg/mL系列标准混合工作溶液。

1.3.2 样品前处理

称取5 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中,加入10 mL温水(40 ℃),1 g淀粉酶,混合均匀置于60 ℃恒温水浴避光振荡30 min,振荡摇匀,加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT,再加入20 mL无水乙醇和10 mL 50% KOH水溶液(V/V),涡旋振荡1 min,皂化30 min(80 ℃水浴),过程中不断振摇。皂化后冷却至室温,用50%乙醇水溶液(V/V)定容至50 mL,离心10 min。上层清液过滤膜后,待测。

1.3.3 色谱条件

在线固相萃取柱:PLRP-S(4.6 mm×12.5 mm,15～20 μm)。色谱柱:Poroshell 120 PFP (4.6 mm×100 mm, 4.0 μm)。进样量:100 μL。流动相梯度洗脱见表1。

表1 在线固相萃取-液相色谱梯度洗脱程序

2 结果与分析

2.1 在线固相萃取条件的优化

目前,维生素E的提取净化依赖于液液萃取,本研究尝试利用固相萃取代替液液萃取过程。固相萃取是通过固体吸附剂选择性吸附和洗脱来实现目标样品的富集和纯化,在实际操作过程中,一般包括平衡、上样、洗脱转移、再平衡几个步骤。在线固相萃取模块主要为液相泵结合六通阀,利用仪器软件设置不同的溶剂比例以及切换时间,实现维生素E的在线提取净化。

样品经过酶解、皂化过程后,经过在线固相萃取柱净化,选择固相萃取柱时,需要选择对强碱性溶液耐受力好的填料。选取PLRP-S柱和C18柱进行在线固相萃取,并对比其净化效果。如图1所示,C18柱净化效果较差,尤其是对于α-维生素E回收率较低。PLRP-S柱为聚合物填料,化学性质稳定,对维生素E提取净化效果良好(图2),所以本方法选用PLRP-S柱作为在线固相萃取柱。

图1 C18柱在线固相萃取4种维生素E色谱图

图2 PLRP-S柱在线固相萃取4种维生素E标准品的色谱图(Poroshell 120PFP色谱分离柱)

在线固相萃取过程中对平衡、上样、淋洗步骤的溶剂比例进行优化。平衡过程比较了60%甲醇水、80%甲醇水、60%乙腈水、80%乙腈水(V/V)4种溶剂,结果显示80%甲醇水对固相萃取柱的活化再生效果较好,最终选择其作为平衡溶剂。分别用30%乙腈水、60%乙腈水、90%乙腈水(V/V)将样品引入固相萃取柱,当选择90%乙腈水作为上样溶剂时,固相萃取柱对4种维生素E具有较好的富集作用。甲基叔丁基醚和乙腈具有良好的溶解性,能除去固相萃取柱上样品皂化液中残留的无机盐、蛋白质、脂肪酸和其他非皂化物等杂质,因此选用50%乙腈/甲基叔丁基醚(V/V)对固相萃取柱进行淋洗。综上,选取PLRP-S柱作为在线固相萃取柱,80%甲醇水(V/V)平衡,90%乙腈水上样,50%乙腈/甲基叔丁基醚(V/V)淋洗,然后进入色谱柱分析。

2.2 色谱分析条件的优化

α,β, γ, δ-维生素E 是同分异构体,其结构性质相近,色谱分离难度较大,尤其是β-维生素E和γ-维生素E只有乙酰醇环上的一个甲基位置不同[20]。以往的文献中,大多通过正向色谱实现4种维生素E的基线分离[21],但反相色谱应用范围更广,与样品溶液相容性好,使用的有害溶剂较少,并且色谱柱的稳定性和耐受度更强[22]。本文用五氟苯基硅烷键柱(PFP)用于4种维生素E的分离,成功地将β-维生素E和γ-维生素E分离开。此外,也对比了其他两种色谱柱C8、C18的分离效果,均不能实现β-维生素E和γ-维生素E基线(图3),因此选用Poroshell 120 PFP柱作为色谱分离柱。

图3 色谱柱C8、C18分离4种维生素E色谱图

建立液相色谱条件时,需要考虑流动相兼容性。本文分别采用甲醇-水和乙腈-水作为流动相分离4种维生素E,优化梯度分离条件。结果表明,乙腈不能使β-维生素E和γ-维生素完全分离(图4),最终选择甲醇作为洗脱溶剂。对甲醇-水梯度洗脱进一步优化,发现甲醇浓度达到100%(V/V)时,分离效果良好,梯度洗脱条件见表1。

图4 乙腈-水分离4种维生素E效果图

2.3 线性范围与定量限

对上述优化条件进行方法学考察。结果见表2, 4种维生素E线性关系良好,R2均大于0.995。将混合标准溶液加入空白基质中,经前处理后以S/N=10计算各组分的定量限,得出4种维生素E的定量限均为50 μg/100 g,与 GB 5009.82—2016(定量限为120 μg/100g)相比较低。

表2 线性范围、校准曲线及定量限

2.4 回收率与精密度

以大米粉作为空白样品,加入4种维生素E的标准溶液,每个浓度重复做6个样品。按1.3.2皂化后,利用在线固相萃取-液相色谱法测定方法的回收率和精密度,结果见表3。由表3可知,4种维生素E的加标回收率为91.2%～102.0%,相对标准偏差为1.69%～4.58%,所建方法各项性能参数满足检测需求。

表3 4种维生素E的加标回收率和精密度

2.5 实际样品测定

为进一步验证本方法对米粉中维生素E检测的适用性,选择在售的6种实际样品,每个样品做两个平行样品,利用在线固相萃取-液相色谱法测定其维生素E含量,结果显示其平行性和重复性良好。表4将测定结果与样品标示值进行比较,相对标准偏差均小于5%,表明本方法测量准确性良好,适用于实际样品米粉中维生素E的测定。

表4 在线固相萃取-液相色谱法测定米粉样品中维生素E的结果

3 结 论

本文建立了在线固相萃取-液相色谱法同时测定米粉中4种维生素E含量的方法。本方法利用固相萃取取代传统的液液萃取,降低了石油醚等有机试剂的使用数量,节约了实验成本。此外,将固相萃取柱与液相色谱仪在线耦合,实现了自动化分析,有效避免人工操作带来的实验误差,提高了检测效率。经验证,该方法回收率和重复性良好,适用于检测日常米粉样品。