王晨雨，付子航，陈成诚，陈姝彤，张平平，甘宇鑫，张军兵，3，张爱琳，江慎华，3*

（1.天津农学院 食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.九江学院药学与生命科学学院，江西 九江 332000；3.江西丹霞生物科技股份有限公司，江西 鹰潭 335000）

原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）是一种天然酚酸，广泛存在于日常饮食和中草药中（如姜黄）[1]，也是人体肠道微生物群降解多酚（特别是花青素或原花青素等类黄酮类）的代谢产物[2]，具有抗氧化[3]、抗过敏[4]、神经保护[5]和抗骨质疏松[6]等多种活性。

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是一种磷糖球蛋白，分子量为42～47 kDa，是蛋清蛋白的主要成分，由385个氨基酸组成，50%氨基酸疏水、33%氨基酸带电，显示出其作为亲脂成分高效载体的潜力[7]。OVA 作为一种载体，已被广泛用于研究小分子与OVA 之间的结合机制，包括结合方式和作用力。已有研究结果表明，OVA能够有效改善小分子水溶性、稳定性和生物利用度[8]。

多酚与蛋白质的相互作用可能会使蛋白质的相关特性发生改变。Seczyk 等[9]指出，酚类化合物与蛋白质的不可逆结合可能会影响蛋白质的消化吸收及氨基酸的生物利用度。同时多酚与蛋白质发生相互作用，可能会对食品营养和功能特性产生影响。由此可见，生物活性成分与载体络合具有较多优势，会发生很多变化，了解两者之间的相互作用和结合机制至关重要[10]。龙梅等[11]研究发现，PCA 能够猝灭鱼精DNA的本征荧光，且猝灭机理为静态猝灭。但是，PCA 与OVA 相互作用及其作用机制目前尚不清楚。

综上，本文采用多光谱技术对PCA 与OVA 的相互作用及其机制进行研究，并测定相互作用前后对ABTS+自由基清除能力的影响，以期为拓宽PCA 和OVA 在食品工业中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

PCA（纯度≥97%）、OVA 冻干粉（纯度＞98%）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS]、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾（均为分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

荧光分光光度计（F-7000）：日本日立公司；酶标仪（SpectraMax 190）：美谷分子仪器（上海）有限公司；pH计（PB-10）：Sartorius 仪器设备有限公司；双光束紫外-可见分光光度计（TU-1901）：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液配制

OVA 采用0.05 mol/L、pH7.4 磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）溶解、得到1×10-5mol/L 储备液，PCA 采用去离子水溶解。

1.3.2 荧光光谱测定

参照Wang 等[12]方法，稍加修改。取3.0 mL 浓度为1×10-5mol/L 的OVA 溶液于荧光比色皿中，连续滴加10 μL 浓度1×10-2mol/L 的PCA 溶液、充分混匀，分别于284、291、298 K 条件下水浴静置5 min 使其平衡。荧光分光光度计狭缝宽度设置为5 nm，激发波长（λex）分别设置为280 nm[色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）均被激发]和295 nm（仅Trp 被激发），发射光谱（λem）在300～450 nm 处以1 200 nm/min 的扫描速率读取。在284、291、298 K 记录OVA 的荧光发射光谱，以评价温度对PCA 与OVA 相互作用的影响。

1.3.3 紫外-可见光谱测定

于298 K 条件下扫描样液在190～500 nm 的紫外-可见光谱，以PBS 缓冲液作为空白对照。

1.3.4 同步荧光光谱测定

同时改变激发和发射单色器获得284 K 同步荧光光谱，狭缝宽度均为5 nm。激发和发射波长的差值（△λ=λem-λex） 分别固定在15 nm 和60 nm。当△λ=15 nm 时（λem=275 nm，λex=260～320 nm） 仅显示Tyr残基的特征光谱；当△λ=60 nm 时（λem=310 nm，λex=250～320 nm）仅显示Trp 残基的特征光谱[13]。所有样品恒温孵育5 min 后进行测量。

1.3.5 三维荧光光谱测定

狭缝宽度为5 nm，扫描速度60 000 nm/min，测定激发波长200～400 nm、发射波长200～600 nm 的三维荧光光谱，增量为5 nm。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力测定

采用Moghadam 等[14]方法稍作修改，测定样品对ABTS+自由基清除活性。采用5 mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.4）溶解得到ABTS 原液，将7 mmol/L ABTS 原液与2.45 mmol/L 过硫酸钾等体积混合，室温避光静置12～16 h，使其生成ABTS+自由基。再将ABTS+溶液在734 nm 波长监测下稀释至吸光值为0.70±0.02。分别将50 μL 浓度0.012 5～0.400 0 μg/mL 的样品溶液与100 μL 稀释后的ABTS+溶液混合，室温避光反应10 min，测734 nm 处吸光值。用磷酸缓冲液代替样品为对照。采用以下公式计算样品对ABTS+自由基清除活性。

式中：X 为ABTS+自由基清除率，%；A0和A 分别为对照和样品的吸光值。

1.4 数据处理

每组试验均独立重复3 次，所有数据用平均值±标准差表示，采用单因素方差分析与最小显著性差异法检验比较各组差异，p<0.05 为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 PCA 对OVA 荧光猝灭效果的测定

对于大分子，荧光测量可以在分子水平上给出小分子物质与蛋白质大分子结合的信息，如结合常数、结合位点数、热力学参数、相互作用力和作用机理等[12]。荧光发射光谱可用来获得OVA 三级结构构象变化的信息，氨基酸残基是主要的荧光团[15]。OVA 的荧光来源于Trp、Tyr 和苯丙氨酸（Phe）残基。同时，OVA 的本征荧光特性对其微环境非常敏感，一些因素（如蛋白质构象转变、亚单位结合、底物结合和变性）会导致蛋白质的本征荧光变化。因此，蛋白质的本征荧光可以提供关于其结构和动力学的大量信息[16]。图1 为在pH7.4 条件下，加入PCA 的OVA 在λex=280 nm 处的荧光发射光谱。

图1 不同温度下PCA 与OVA 相互作用荧光光谱Fig.1 Fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由图1 可知，在不同温度下，OVA 的荧光强度随PCA 浓度增加逐渐降低，最大发射波长没有明显变化，表明PCA 与OVA 之间存在相互作用，PCA 与OVA 的结合对荧光团周围的微环境没有太大影响。Li 等[17]对原花青素与OVA 相互作用的研究结果与本文结论一致。

2.2 PCA 对OVA 荧光猝灭机理分析

荧光猝灭表示大分子与猝灭剂分子的各种相互作用引起荧光量子产率的降低，即荧光强度的降低。OVA 的本征荧光对其微环境非常敏感，当OVA 周围微环境稍有改变时，其本征荧光会明显减弱，蛋白质构象转变、生物分子结合与变性等因素是导致荧光强度减弱的原因[18]。该过程可由多种机制引起，通常包括动态猝灭和静态猝灭[10]。温度效应会导致静态猝灭不同于动态猝灭。在动态猝灭过程中，温度越高、扩散系数越大，荧光团和猝灭剂之间的碰撞次数越多，猝灭常数随着温度的升高而增大；而在静态猝灭过程中，荧光团和猝灭剂之间形成基态络合物，猝灭常数随温度增加而减小[19]。使用Stern-Volmer 方程分析不同温度下的荧光数据可阐明荧光猝灭机理[10]，公式如下。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q]

式中：F0和F 分别为不存在和存在PCA 时OVA 的稳态荧光强度；Ksv 为Stern-Volmer 猝灭常数，L/mol；[Q] 为PCA 浓度，mol/L；Kq 为双分子扩散猝灭速率常数，2.0×10-10L/（mol·s），τ0为没有与PCA 结合时荧光团的平均寿命，10-8s。

在2.1 中发现PCA 对OVA 荧光会产生猝灭效果。采用Stern-Volmer 方程对猝灭作用机理进行分析。图2 为在不同温度（284、291、298 K） 下的Stern-Volmer线性图，相关参数如表1 所示。

表1 不同温度下PCA 对OVA 荧光猝灭的Stern-Volmer 猝灭常数Table 1 Stern-Volmer quenching constants of OVA by PCA at different temperatures

图2 不同温度下PCA 对OVA 荧光猝灭的Stern-Volmer 曲线Fig.2 Stern-Volmer curve for the fluorescence quenching of OVA by PCA at different temperatures

Ksv 反映荧光团对猝灭剂（PCA）的敏感性，有助于确定PCA-OVA 体系中的猝灭机制。由图2 和表1可以发现，在284～298 K 内，Ksv 值随温度升高而降低，表明PCA 与OVA 的相互作用为静态猝灭机制。Kq是衡量相互作用猝灭能力和效率的关键参数[20]。3 种温度下计算得到的双分子扩散猝灭速率常数[4.332×1011、4.098×1011、3.540×1011L/（mol·s）]均远大于最大扩散碰撞猝灭速率常数[2.0×1010L/（mol·s）]，进一步说明PCA 与OVA 相互作用机理为静态猝灭。此外，Kq 值随着温度升高而降低，表明PCA 对OVA 的猝灭过程是一个放热反应。

2.3 结合常数及结合位点数测定

在静态猝灭机制下，结合常数（Ka）和结合位点数（n）可以使用双对数方程计算[21]，公式如下。

log[（F0-F）/F]=logKa+nlog[Q]

式中：Ka 为表观结合常数，L/mol，表示OVA 与PCA 结合的亲和力；n 为结合位点数。

在2.2 中确定猝灭机制后，对PCA 与OVA 相互作用的表观结合常数（Ka）和结合位点数（n）进行测定。图3 为不同温度下PCA 与OVA 相互作用的双对数曲线，结合常数及结合位点数如表2 所示。

表2 不同温度下PCA 与OVA 相互作用的结合常数Table 2 Binding constants of interaction between PCA and OVA at different temperatures

图3 不同温度下PCA 与OVA 相互作用的双对数曲线Fig.3 Double logarithmic curve of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由表2 可知，Ka 值均大于1×104L/mol，表明PCA与OVA 具有较强的结合能力。Ka 值随温度升高而升高，表明PCA 与OVA 的络合稳定性与温度成正比。此外，在284～298 K 温度范围内，n 值均接近于1，显示PCA与OVA 络合物的化学计量比为1∶1，表明不同温度下PCA 与OVA 只有一个结合位点。

2.4 热力学参数及相互作用力判断

通常，反应过程中焓变（ΔH）和熵变（ΔS）是确定小分子与蛋白质结合方式的主要热力学参数，由van’t Hoff 方程（Eq）计算得到[22]。

ln Ka=-ΔH/RT+ΔS/R

ΔG=ΔH-TΔS

式中：T 为热力学温度，K；R 为气体常数，8.314 J/（mol·K）；ΔG 为吉布斯自由能变，kJ/mol；ΔH 为焓变，kJ/mol；ΔS 为熵变，J/（mol·K）。

通过对热力学参数的研究，可以验证作用过程的自发性，并探讨蛋白质与配位体相互作用的机理。判断主要结合驱动力的热力学定律包括：1）ΔH>0、ΔS>0 或ΔH>0、ΔS<0 时，表示疏水相互作用为主要作用力；2）ΔH<0、ΔS<0 时，范德华力和氢键占主导；3）ΔH<0、ΔS>0时，主要作用力为静电相互作用[23]。在2.3 计算出不同温度下结合常数Ka 后确定的热力学参数如表3 所示。

表3 不同温度下PCA 与OVA 相互作用的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between PCA and OVA at different temperatures

由表3 可知，ΔG 为负值，表明PCA 与OVA 的结合是自发过程；ΔH 和ΔS 均大于0，表明自发过程是由熵驱动的吸热反应，主导作用力是疏水相互作用。Ge 等[24]研究发现，疏水相互作用也是姜黄素及其衍生物与牛血清白蛋白相互作用的主要驱动力。

2.5 同步荧光光谱检测PCA 对OVA 微环境变化

同步荧光光谱灵敏度高、选择性好、干扰少，可以提供关于配体影响荧光团周围微环境变化的重要信息[25]。因此，在2.1～2.4 基本确定PCA 与OVA 相互作用后，进一步通过同步荧光光谱检测PCA 对OVA 构象变化的影响，结果如图4 所示。

图4 284 K 条件下PCA 与OVA 相互作用的同步荧光光谱Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at 284 K

配体引起的蛋白质荧光猝灭意味着蛋白质氨基酸残基周围的极性改变[26]。由图4 可知，随着混合体系中PCA 浓度逐渐增加，两个波长间隔下的荧光强度均呈现规律性下降，同时观察到Tyr 残基最大发射波长发生红移（从288.6 nm 到303.0 nm），而Trp 残基的最大发射波长没有发生明显变化，表明PCA 与OVA 相互作用使Tyr 残基周围微环境极性增加、疏水性降低，而Trp残基所处微环境几乎没有发生变化。此外，Δλ=60 nm时的猝灭间距比Δλ=15 nm 处的猝灭间距更明显，意味着结合位置更接近Trp 残基[27]。

2.6 三维荧光光谱检测OVA 微环境变化

三维荧光光谱可以同时改变激发和发射波长，进而提供更科学、更可靠的蛋白质结构和微环境变化的细节，能够证明蛋白质在与配体结合时构象发生了变化[25]。图5 为PCA 不存在和存在时OVA 的三维荧光光谱，相关特征参数如表4 所示。

表4 PCA 不存在和存在下OVA 的三维荧光光谱特征参数Table 4 Characteristic parameters in three-dimensional fluorescence spectra of OVA in the absence and presence of PCA

图5 284 K 条件下PCA 与OVA 相互作用的三维荧光光谱Fig.5 Three-dimensional fluorescence spectra of interaction between PCA and OVA at 284 K

由图5 可知，主要有4 个特征峰，峰A 和峰B 分别表示利散射峰和二阶瑞利散射峰，对应波长分别为λex=λem 和2λex=λem，其特征是化合物溶解的溶剂进行辐射再发射，并且一小部分吸收的辐射在同一波长向各个方向散射[25]。峰1 提供了由于π-π* 跃迁而与二级结构相关的多肽骨架结构的光谱行为信息，峰2（λex=280.0 nm）反映的主要是Trp 和Tyr 残基的本征荧光[28]。与OVA 相比，加入PCA 后峰1（λex 235.0 nm/λem 330.0 nm）的荧光强度从1 273.0（图5a）明显下降至181.7（图5b），峰2 的荧光强度从4406.0（图5a）明显下降至1 748.0（图5b），且从280.0 nm 明显红移至325.0 nm。结果表明PCA 与OVA 之间存在相互作用，且蛋白质的二级结构可能发生了变化、氨基酸残基所处微环境的极性增加，该结果与同步荧光结果一致。

2.7 紫外-可见光谱检测PCA 与OVA 相互作用

通过检查荧光团的吸收光谱不仅可验证猝灭类型，还可用于研究蛋白质发色团周围微环境的变化和蛋白质配体复合体的形成。动态猝灭只影响荧光团的激发态，因此吸收光谱不会发生改变。然而，由于基态络合物的形成，静态猝灭经常导致荧光团吸收光谱的扰动[29]。为了进一步验证PCA 与OVA 相互作用的机理及对蛋白质产生的影响，在298 K 条件下测定OVA及PCA-OVA 复合物的紫外-可见光谱，结果如图6所示。

图6 298 K 条件下PCA 与OVA 相互作用的紫外-可见光谱Fig.6 Ultraviolet-visible spectrum of interaction between PCA and OVA at 298 K

由图6 可知，280 nm 附近显示出吸收峰是由于蛋白质的生色团（芳香族氨基酸）对紫外线的吸收，常被用来反映蛋白质构象的变化[30]。随着PCA-OVA 体系中PCA 浓度的增加，280 nm 处吸收峰略有增加，且在相互作用后发生了轻微红移（从280 nm 到287 nm），表明PCA 和OVA 之间存在相互作用，并形成了基态复合物，再次证明PCA 对OVA 的荧光猝灭机制是静态猝灭；同时表明PCA 与OVA 的相互作用影响了蛋白质构象，并改变了OVA 芳香族氨基酸残基周围的微环境，与同步荧光及三维荧光光谱结论一致。

2.8 PCA 与OVA 及其复合物对ABTS+自由基清除能力的影响

ABTS+自由基清除法是评价抗氧化能力最常见方法之一，本研究采用该方法对PCA、OVA 及PCA-OVA 复合物对ABTS+自由基清除能力进行测定，结果见图7。

图7 PCA、OVA 及PCA-OVA 复合物对ABTS+自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of PCA，OVA and PCA-OVA complexes against ABTS+ radical

由图7 可知，游离PCA、OVA 和PCA-OVA 复合物均表现出ABTS+自由基清除活性，且清除能力均随浓度增加而增强。在相同浓度下，PCA-OVA 复合物的抗氧化活性较PCA 有显著提高（p＜0.05）。Liu 等[8]在研究姜黄素与OVA 结合前后清除DPPH 自由基活性变化时也发现了类似的研究结果。

3 结论

本文运用多光谱技术对PCA 与OVA 相互作用的机理进行研究，并通过ABTS+自由基清除试验考察PCA 与OVA 相互作用对PCA 抗氧化性能的影响。结果显示，在284～298 K 温度范围内，PCA 与OVA 具有一个较强亲和力的结合位点；PCA 与OVA 的结合过程通过疏水作用力自发进行，并使Tyr 残基周围微环境极性增加，疏水性降低。PCA 与OVA 结合改变了对ABTS+自由基的清除能力。本研究为拓宽PCA 和OVA在食品工业中的应用提供依据。