丘建媚,刘付薇,陈星梅,庄远杯,张声源,吴俊标

(1.广州中医药大学第二临床医学院,广州 510006;2.梅州市中医医院药学部,梅州 514071;3.嘉应学院广东省山区特色农业资源保护与精准利用重点实验室,梅州 514015;4.广州中医药大学第二附属医院药学部,广州 510120)

2021年全球成年糖尿病患者达5.37亿例,造成医疗卫生支出超过9 660亿美元[1-2]。餐后高血糖是2型糖尿病发病历程之一,是引起血管并发症的重要因素[3]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是延缓餐后血糖升高的关键靶点[4-5]。现用于临床的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂具有一定的胃肠道副作用和肝毒性,胃肠和肝功能不全者并不适用[6]。我国中草药植物资源丰富,很多中草药疗效确切、副作用小,是挖掘新药先导化合物的重要源泉,已从中研发创新药物40余种[7]。客家人沿袭了中原医药习惯,且在迁徙过程中形成独具客家特色的用药习惯。梅州市是“世界客都”,所辖蕉岭县是世界第七个、全国第四个“长寿之乡”,其长寿与崇尚“寓医于食”关系密切,形成的独具地域特色的客家菜系是广东三大菜系之一[8]。梅州客家习用药膳,梅州民间常用中草药有193种,常将中草药配以龙骨、鸡、鸭等煲汤,有餐前喝汤的饮食习惯,这与阿卡波糖等降低餐后血糖的药物在餐前服用一致[9-10],笔者前期研究发现梅州客家常用药膳汤料牛奶树根等具有良好的体外α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性[11]。传统用药经验是创新药物挖掘的线索和依据,笔者从梅州客家常用药膳、凉茶中选取使用频数较高41种中草药,探究其对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的影响,并对活性最强的品种通过酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线探究其对酶的抑制作用类型,为α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制剂的研发提供实验数据和参考依据。

1 材料与方法

1.1药物 41种供试中草药样品采自梅州市梅江区,经嘉应学院医学院客家药用生物资源研究所张声源副教授鉴定为所属品种,药用植物详细信息见表1,样品标本留存于嘉应学院医学院天然药物标本馆(编号:202206001-202206041)。

表1 供试中草药样品信息Tab.1 Information of Chinese herbal medicine sample for testing

1.2试剂 α-葡萄糖苷酶(批号:079M4145V)、牛血清蛋白(BSA,批号:WXBC2903V)、α-淀粉酶(批号:SLCG0041)均购自Sigma有限公司,对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside,pNPG,上海源叶科技有限公司,批号:K04F8B28175),阿卡波糖(德国拜耳有限公司,批号:BJ50338,规格:每片50 mg),3,5二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS,国药集团化学试剂有限公司,批号:20170904),葡萄糖(西陇科学股份有限公司,批号:1611021),可溶性淀粉(天津市大茂化学试剂厂,批号:20180501),无水碳酸钠(批号:C10900552)、磷酸氢二钾(批号:C11105355)、磷酸二氢钾(批号:C11083450)、对硝基苯酚(批号:C10631132)均购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.3仪器与设备 WJX-A1000型高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司),KQ-700DV数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),BT125D型电子分析天平(德国赛多利斯有限公司,感量:0.1 mg),BS110s型电子分析天平(德国赛多利斯有限公司),N-1100V型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司),DHG-9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),数显HH-4系列电热恒温水浴锅(安庆洁佳仪器设备有限公司),PHS-3C酸度计(上海锦幻仪器仪表有限公司),MING-CHE 24UV超纯水机(法国Merck Millipore公司),Spark型多功能酶标仪[帝肯(上海)贸易有限公司]。

1.4提取物的制备 41种中草药经50 ℃烘干,粉碎,过筛[80目,筛孔内径为(180±7.6) μm],称取中草药粉末各2.0 kg,95%乙醇超声提取3次(45 ℃,700 W,40 kHz,30 min),四层纱布过滤,合并滤液,浓缩得浸膏,真空干燥,备用。样品使用前用蒸馏水溶解,8 000 r·min-1(r=100 mm)离心10 min,4 ℃冷藏备用[12]。

1.5对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用 于96孔板上依次加入磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH值6.8)110 μL,样品溶液10 μL,0.1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶溶液20 μL,混匀,37 ℃恒温孵育15 min后,加入4 mmol·L-1pNPG溶液20 μL,混匀,37 ℃恒温反应15 min,加入0.2 mol·L-1碳酸钠溶液80 μL,于波长405 nm处测定吸光度,即为样品组(C),实验以阿卡波糖为阳性对照,同时设空白组(A),空白对照组(B),背景对照组(D),各实验组体系见表2[13]。α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100%。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制实验各试剂加入量Tab.2 Dosage of each reagent in α-glucosidase inhibition experiment μL

1.6对α-淀粉酶活性的抑制作用 于5 mL试管依次加入样品溶液120 μL,α-淀粉酶溶液120 μL,混匀,37 ℃孵育5 min,加入1%可溶性淀粉溶液120 μL,混匀,37 ℃反应15 min,立即加入DNS 200 μL显色并置于沸水中煮沸5 min终止反应,随后放置于冰水中静置5 min,加入PBS溶液1 040 μL,于540 nm下测定吸光度,即为样品组(C),实验以阿卡波糖为阳性对照,同时设空白组(A),空白对照组(B),背景对照组(D),各实验组体系见表3[14]。α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(C-D)/(A-B)]×100%。

表3 α-淀粉酶抑制实验各试剂加入量Tab.3 Dosage of each reagent in α-amylase inhibition experiment μL

1.7对α-葡萄糖苷酶抑制作用动力学 在pNPG浓度为4 mmol·L-1条件下,分别测定3组不同浓度样品在不同α-葡萄糖苷酶活力(0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 U·mL-1)时的酶促反应初速度,以α-葡萄糖苷酶活力(U·mL-1)对酶促反应初速度(mmol·L-1·min-1)作图,判断其对α-葡萄糖苷酶的可逆或不可逆抑制类型。在α-葡萄糖苷酶活力为0.1 U·mL-1,分别测定3组不同浓度样品在不同pNPG浓度(0.5、1、2、4、8、16 mmol·L-1)时的酶促反应初速度,以pNPG浓度的倒数对酶促反应初速度的倒数绘制Lineweaver-burk双倒数曲线,计算得出动力学参数Vmax和Km,判断其对α-葡萄糖苷酶的竞争、非竞争或反竞争抑制类型[15]。

1.8对α-淀粉酶抑制作用动力学 固定淀粉浓度为10 mg·mL-1,分别测定3组不同浓度样品在不同α-淀粉酶活力(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1)下的酶促反应初速率,以酶活力为横坐标,反应初速率为纵坐标作图,判断其可逆或不可逆抑制类型。在α-淀粉酶活力为0.3 mg·mL-1条件下,测定3组不同浓度样品在不同淀粉浓度(0.75、1.25、2.5、5、10 mg·mL-1)的反应初速率,以淀粉浓度的倒数为横坐标,反应初速率的倒数为纵坐标绘制Lineweaver-Burk 曲线,计算得出动力学参数Vmax和Km,判断其对α-淀粉酶的竞争、非竞争或反竞争抑制类型[16]。

2 结果

2.1对α-葡萄糖苷酶的抑制作用 见表4,41种梅州客家常用中草药中,40种具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC50值低于10 mg·mL-1有15种,分别为九节、马尾松、地棯、绞股蓝、姜薯、桑白皮、桑叶、金线吊乌龟、了哥王、艾根、艾叶、枸杞叶、溪黄草、土茯苓、野山楂,其中九节、马尾松、土茯苓3种中草药抑制活性强于阳性对照阿卡波糖,抑制活性最强的为九节[IC50=(0.170±0.001) mg·mL-1]。

表4 样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Tab.4 The inhibitory activity of samples on α-glucosidase

2.2对α-淀粉酶的抑制作用 见表5,41种梅州客家常用中草药中,23种具有一定的α-淀粉酶抑制活性,IC50值低于10 mg·mL-1的有4种,分别为九节、马尾松、地棯、红冬蛇菰,但抑制活性均低于阳性对照阿卡波糖,其中九节在41种梅州客家常用中草药中抑制活性最强(IC50=0.090±0.001 mg·mL-1),抑制活性接近于阿卡波糖[IC50=(0.068±0.001) mg·mL-1]。

表5 样品对α-淀粉酶的抑制活性Tab.5 The inhibitory activity of samples on α-amylase

结合表4、表5可知,41种梅州客家常用中草药中九节具有最强的α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性,故进一步探讨其酶抑制类型。

2.3对α-葡萄糖苷酶的抑制作用动力学实验

2.3.1阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型 由图1可知,以酶活力为横坐标,酶促反应初速度为纵坐标,阿卡波糖浓度为0、1、2 mg·mL-1的3组拟合直线相交于原点,且随质量浓度的增大,直线斜率越小,即反应初速率越小,为可逆性抑制类型。图2可知,以pNPG浓度的倒数(1/S)为横坐标,酶促反应初速率的倒数(1/V0)为纵坐标,阿卡波糖质量浓度为0、1、2 mg·mL-1的3组拟合直线相交于Y轴正半轴的同一点,即Vmax不变,值为16.13 mmol·L-1·min-1,且随着质量浓度的增大,Km值增大,为竞争性抑制类型。由此可知阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为可逆竞争性抑制。

图1 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶酶促反应初速率的影响Fig.1 Effect of acarbose on the enzymatic reaction initial rate of α-glucosidase

图2 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.2 Lineweaver-Burk curves of acarbose on α-glucosidase

2.3.2九节对α-葡萄糖苷酶抑制类型 由图3可知,九节提取物质量浓度为0、0.045、0.09 mg·mL-1的3组拟合直线相交于原点,且随浓度的增大,直线斜率越小,即反应初速率越小,为可逆性抑制类型。九节提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk 双倒数曲线结果见图4,3组直线相交于Y轴正半轴的同一点,且随着质量浓度的增大,Km值增大,为竞争性抑制类型。由此可知九节对α-葡萄糖苷酶的抑制类型为可逆竞争性抑制。

图3 九节对α-葡萄糖苷酶酶促反应初速率的影响Fig.3 Effect of Psychotria rubra on the enzymatic reaction initial rate of α-glucosidase

图4 九节对α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.4 Lineweaver-Burk curves of Psychotria rubra on α-glucosidase

2.4对α-淀粉酶的抑制作用动力学实验

2.4.1阿卡波糖对α-淀粉酶抑制类型 由图5可知,以酶活力为横坐标,酶促反应初速度为纵坐标,阿卡波糖质量浓度为0、0.03 4、0.068 mg·mL-1的3组拟合直线相交于原点,且随质量浓度的增大,直线斜率越小,即反应初速率越小,为可逆性抑制类型。图6可知,以淀粉浓度的倒数(1/S)为横坐标,酶促反应初速率的倒数(1/V0)为纵坐标,阿卡波糖浓度为0、0.034、0.068 mg·mL-1的3组拟合直线相交于第二象限,为竞争性与非竞争性混合型。由此可知,阿卡波糖对α-淀粉酶为可逆的竞争性与非竞争性混合型抑制类型。

图5 阿卡波糖对α-淀粉酶酶促反应初速率的影响Fig.5 Effect of acarbose on the enzymatic reaction initial rate of α-amylase

图6 阿卡波糖对α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.6 Lineweaver-Burk curves of acarbose on α-amylase

2.4.2九节对α-淀粉酶抑制类型 由图7可知,九节提取物浓度为0、0.022 5、0.09 mg·mL-1的3组拟合直线相交于原点,且随质量浓度的增大,直线斜率越小,即反应初速率越小,为可逆性抑制类型。九节提取物对α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk 双倒数曲线结果见图8,三组直线交于X负轴同一点,即抑制常数Ki不变,为1.05 mg·mL-1;斜率随着浓度的增大而增大,反应速率Vmax随抑制剂浓度增大而变小,为典型的非竞争性类型。由此可知,九节提取物对α-淀粉酶抑制作用为可逆非竞争性抑制。

图7 九节对α-淀粉酶酶促反应初速率的影响Fig.7 Effect of Psychotria rubra on the enzymatic reaction initial rate of α-amylase

图8 九节对α-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.8 Lineweaver-Burk curves of Psychotria rubra on α-amylase

3 讨论

笔者在本实验采用pNPG法、DNS法研究发现,41种梅州客家常用中草药中40种具α-葡萄糖苷酶抑制活性、23种具α-淀粉酶抑制活性,对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具抑制活性的有22种,其中九节对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制活性最强,IC50分别为(0.17±0.001)、(0.09±0.001) mg·mL-1。阿卡波糖导致的胃肠胀气副作用与其对α-淀粉酶的过度抑制有关[17],与阳性对照阿卡波糖比较,梅州客家常用凉茶九节(Psychotriaasiatica)对α-葡萄糖苷酶抑制活性强于阿卡波糖[IC50=(2.060±0.001) mg·mL-1],对α-淀粉酶抑制活性低于阿卡波糖[IC50=(0.068±0.001) mg·mL-1],提示九节可能具有更强的降血糖活性和更高的安全性。进一步采用酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线分析显示,九节对α-葡萄糖苷酶为可逆竞争性抑制类型,这与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型一致;而九节对α-淀粉酶为可逆非竞争性抑制,表明九节是通过作用于酶活性中心之外的基团影响底物的分解[18],这与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制类型不同,提示九节极有可能是一种新型的糖苷酶抑制剂,后续可采用活性靶向分离技术和波谱技术获得活性先导化合物,采用细胞、动物水平探究降血糖作用机制。本研究通过高通量筛选梅州客家41种常用中草药对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制活性,明确了九节具有良好的抑制活性,后续可对九节开展系统的降血糖活性成分及其作用机制,进一步明确其食用和药用的科学内涵。