黄晓燕，邹孟龙，陈雅璐，宁 芯，陈柏辉，梁巧俐

1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023； 2 广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530001

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性复发性直肠及结肠炎症性疾病，临床表现为腹痛、腹泻、便血等［1］。UC的发病机制尚不明确，通常被认为与肠道菌群失调、免疫反应紊乱等密切相关［2］。在临床实践中，常规治疗UC 多使用氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫调节剂等药物［1］。然而，长期的西药治疗不仅给患者带来了巨大的经济负担，而且治疗后患者仍有较高的复发［3-4］。因此，探索UC新治疗策略十分有必要。

铁死亡是近年来被新发现的一种细胞程序性死亡，主要病理是脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）和铁离子的积聚导致线粒体体积变小、双层膜更致密、嵴减少及外膜破裂［5-6］。同样地，研究表明铁死亡诱导剂作用于谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），会使细胞抗氧化能力降低、ROS 堆积，最终引起细胞氧化性死亡［7］。这表明ROS堆积是铁死亡的基本特征。值得提出的是，胃肠道是ROS 产物的主要来源，而肠道黏膜抗氧化剂的含量较少，肠道更容易受到氧化应激的损害［8-9］。与此同时，随着UC的发展，肠道免疫细胞浸润明显增加，诱导了促氧化分子的产生，进而加快ROS堆积［10-11］。总而言之，细胞铁死亡参与了UC的发生发展。

近年来，中医药文化在传承创新中蓬勃发展，同时，生物信息学、网络药理学等工具的出现，为中药的临床运用提供了更有力的证据。因此，不少学者开始探索中药治疗UC 的新策略。WANG等［12］发现莪术苷能下调GPX4 的表达、抑制细胞铁死亡，从而发挥治疗UC 的效用。与西药相比，中药不仅能降低患者的经济负担，而且能从整体上有效治疗UC［13］。基于此，本研究利用生物信息学工具，对UC 患者和健康受试者的结肠组织进行基因表达分析，初步筛选得到与铁死亡相关的UC 差异表达基因，并对相关中药进行预测，旨在为探索治疗UC新策略提供参考。

1 数据库与软件

1.1 数据库GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；STRING 数 据 库（http：//string-db.org/，Version 11.0）；Coremine 数据库（http：//www.coremine.com/）。

1.2 软件Cytoscape 软件（Version 3.8.0）；R语言（x64 4.0.3）；Perl语言（Strawberry 5.32）。

2 方法

2.1 研究方案利用GEO 数据库筛选UC 差异表达基因；通过常用的中文及英文数据库检索铁死亡相关基因，然后绘制UC 差异基因与铁死亡相关基因的Venn图，取得交集基因。通过STRING数据库对交集基因进行蛋白相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）；借助Coremine 数据库预测潜在治疗中药，筛选出具有调控细胞铁死亡防治UC 效用的中药，最后对得到的中药进行归纳。方案流程见图1。

图1 研究方案流程

2.2 UC 差异表达基因的筛选以“溃疡性结肠炎”的英文“ulcerative colitis”为关键词在GEO 数据中检索，经阅读后筛选并下载编号GSE38713 的芯片数据。该芯片数据包含28 例患者基因表达信息，见表1。

表1 UC样本信息

2.3 铁死亡相关基因以“铁死亡”为关键词，在中国知网数据库、重庆维普数据库及万方数据库中检索，同时以“铁死亡”的英文“ferroptosis”为关键词，在PubMed、Embase 及Cochrane library数据库中检索，综合得到铁死亡相关基因。

2.4 UC 与铁死亡的交集基因将“2.2”项得到的UC 差异表达基因与“2.3”项得到的铁死亡相关基因进行映射取交集，绘制Venn图。

2.5 PPI 网络构建将“2.4”项得到的交集基因导入STRING 数据库，构建PPI 网络，初步预测与UC相关的核心铁死亡基因。

2.6 中药治疗预测将交集基因导入Coremine数据库，映射出相关中药，设置P＜0.01 为阈值，筛选出具有调控细胞铁死亡、防治UC 效用的中药，并对预测中药进行归经、功效归纳。

3 结果

3.1 铁死亡相关基因经检索，共得到60 个与铁死亡相关基因［6，14-16］，见表2。

表2 铁死亡相关基因

3.2 UC 差异表达基因的筛选利用R 语言对GSE38713 芯片数据进行整理，将筛选条件设置为|log FC|≥1 且P＜0.05，对健康受试者和UC 患者的结肠组织基因表达进行分析，共获得差异表达基因1355 个。其中在UC 患者结肠组织中上调基因796 个，下调基因559 个，绘制火山图对数据进行可视化，见图2，横坐标表示log FC，纵坐标表示-log10（PValue），圆点表示基因，绿色圆点表示在UC患者结肠组织中下调的基因，红色表示在UC患者结肠组织中上调的基因，黑色表示无明显差异的基因；并对差异倍数最大的前10 个基因绘制热图，见图3（其中每1 列表示1 个样本，下方为样本名称，上方蓝色表示健康受试者，粉色表示UC患者；每1行表示1个基因在不同样本的差异，红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示无明显差异基因；左侧连线表示差异基因的聚类模式）。

图2 差异表达基因火山图

图3 差异倍数排名前10的基因热图

3.3 UC 与铁死亡的交集基因将筛选得到的1355 个UC 差异表达基因与60 个铁死亡相关基因进行映射，得到8个交集基因，见图4及表3。

表3 UC与铁死亡的交集基因

图4 Venn图

3.4 PPI 网络的构建及可视化分析将交集基因导入STRING 数据库，物种选择人类，最低置信度设为0.04，构建PPI 网络。由图5 可知，CD44 可能是细胞铁死亡干预UC进展的核心基因。

图5 PPI图

3.5 中药治疗预测设置P＜0.01 为筛选标准，通过Coremine 数据库预测具有潜在调控细胞铁死亡防治UC 效用的中药，除ACSF2 映射不出相关中药外，其余7 个基因均可映射出相关中药，共得到69 味中药。将结果导入Cytoscape软件进行可视化分析，见图6。该网络中黄芩、三百草、牡丹皮、人参、生姜、干姜、五味子、丹参、木香、三七的度值较高，提示与调控细胞铁死亡防治UC 的关系最密切。将预测得到的中药进行归经、功效归纳，如图7—8 所示。与UC 铁死亡相关中药多归脾经、胃经，且多属于清热、补虚、活血类。

图6 预测中药可视化

图7 中药归经

图8 中药功效

4 讨论

铁死亡是在研究小分子爱拉斯汀（erastin）杀死含有致癌基因RAS 突变的肿瘤细胞的作用机制时被发现的［14-17］。尽管铁死亡最早是在癌细胞中被发现，但其已被证明对多种系统疾病具有重要意义，例如神经系统疾病［18］、泌尿系统疾病［19］、心血管疾病［20］等。值得提出的是，在铁死亡尚未被发现时，已有许多研究表明，铁离子和ROS 可以通过肠道黏膜影响UC 的发生发展［21-22］。然而，铁离子和ROS损伤机制尚未十分明确。XU等［23］研究发现，在人类UC和UC模型小鼠中均可以观察到结肠黏膜中线粒体萎缩、细胞死亡增加、铁及ROS 被上调，与铁离子转运相关的基因转录也明显增加；表明铁死亡通过内质网应激介导肠上皮细胞死亡，从而促进UC的发展。

本研究通过对健康受试者和UC患者的结肠组织基因表达进行差异分析，共获得差异表达基因1355个，其中上调基因796个，下调基因559个。经过检索常用的中文和英文数据库，获得60个铁死亡相关基因；与铁死亡相关的UC 差异表达基因共8个，分别是CD44、DPP4、LPCAT3、PTGS2、SLC7A11、ABCC1、HMOX1、ACSF2，其中CD44 在PPI 网络中度值最高，表明其可能是铁死亡参与UC 的核心基因。CD44又称人类白细胞黏附分子，是一种跨膜受体糖蛋白，介导细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用，参与了细胞增殖、迁移、血管生成等［24］。在UC的进展中，CD44作为潜在的协调刺激分子，招募免疫细胞的聚集、参与T细胞的活化介导慢性炎症的持续发生［25］。对于铁死亡而言，GPX4是介导的关键蛋白。值得思考的是，GPX4活性的抑制不仅是由于ROS来源增多而导致，细胞不能正常催化ROS也可能是导致代谢障碍的原因［5］。亚单元SLC7A11的表达下调导致胞内胱氨酸水平的降低，谷胱甘肽生物合成的缺失，间接导致GPX4的活性被抑制，进而激活铁死亡［26］。LIU 等［27］研究表明，CD44 通过干预亚单元SLC7A11的稳定性，从而调控细胞铁死亡。

UC属于中医学“痢疾”等范畴。根据中医诊疗专家共识［28］，UC多因虚实夹杂导致，系由脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，瘀血阻滞，日久化而为热、为火，湿热内生而成痢疾。本研究预测的中药多归脾经、胃经，药物功效多属于清热类、补虚类、活血类，这进一步说明了此次研究结果符合UC的中医病机。通过软件对预测得到的中药进行拓扑分析，发现黄芩、三百草、牡丹皮、人参、生姜、干姜、五味子、丹参、木香、三七等中药在调控细胞铁死亡防治UC的过程中处于核心地位。黄芩归心、肺、胆、大肠经，具有清热、泻火、祛湿、解毒等功效，常被用于治疗湿热泻痢。徐薇涵等［29］研究表明，黄芩素通过调控热休克蛋白70参与结肠黏膜上皮细胞的修复、机体免疫功能的调节，在治疗UC中发挥抗炎作用。人参、生姜、干姜均具有健脾功效，用四君子汤治疗UC亦收获良效［30］。牡丹皮、丹参、三七均具有活血功效。便血是活动性UC患者的常见并发症。别彩娟［31］以芪仙汤治疗UC，有效率高达96.77%。本研究预测的中药多属于清热类、补虚类、活血类，这不仅与UC的中医病机高度符合，而且不少研究也表明以清热法、补虚法、活血法治疗UC可收获良效。

综上所述，本研究通过生物信息学筛选铁死亡参与UC的核心基因，为探索UC新治疗策略提供方向。本研究通过Coremine 数据库筛选具有调控细胞铁死亡防治UC效用的中药，为探索UC新治疗策略提供选择。但本研究存在一定的局限性：1）样本量有限，可能存在基因表达偏倚；2）可能将生理性差异基因纳入病理性差异基因；3）铁死亡相关基因是课题组检索获得，可能存在遗漏，且目前关于铁死亡基因的研究较少，这同样可能存在偏倚；4）通过Coremine 数据库预测潜在的治疗中药，但部分中药在UC中缺乏实验研究证实。