邹海飞，李 敏，邓顺艳，夏 兵，周 燕*

（1.中国科学院成都生物研究所，四川 成都 610041；2.中国科学院成都有机化学研究所，四川 成都 610041；3.中国科学院大学，北京 101408）

三碘甲腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）和甲状腺素（Thyroxine，T4）是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状腺功能障碍，并可增加心血管疾病［1］、糖尿病并发症［2］和妊娠并发症［3］的发生风险。正常情况下，T3、T4 分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%为游离状态，简称为FT3和FT4［4］。而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关［5］。FT3和FT4的测定不受血清结合蛋白的影响，是甲状腺功能体外实验的灵敏指标，可作为甲亢、甲减、甲状腺肿、重症感染发热等疾病的辅助诊断［6］。

由于血清中FT3 和FT4 临床检测的重要性，50 多年来研究者们相继开发了测定FT3 和FT4 的不同方法。但由于游离甲状腺激素的浓度极低，FT3的血液浓度为1.4～6.0 pg/mL，FT4为8.0～20.0 pg/mL［7］。并且结合态与游离态之间的内源性平衡易受到扰乱，使得其检测结果的重复性、稳定性较差。因此，临床上准确检测游离甲状腺激素仍然十分困难，极具挑战性。目前，临床实验室通常通过免疫分析方法或物理分离方法检测FT3 或FT4。通过免疫法间接测定的FT3、FT4 含量易因其动态平衡被破坏而有误［8-9］。尤其是在妊娠期，由于其结合蛋白的显著变化和嗜异性抗体的存在，使得免疫测定结果不准确［10］。美国甲状腺协会建议，在妊娠期测定FT4 的最佳检测方法为液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法［11］。该法分析灵敏度高、特异性好［12-13］，已成为国外检测人血清中FT3、FT4的金标准方法［14］。在结合态与游离态之间的内源性平衡受干扰最小的情况下，从血清中分离出FT3 和FT4 是该方法前处理环节的关键［15］。经过多年的发展与改进，平衡透析和超滤已成为较为成熟和完善的物理分离技术，然而这两种方法均因其自身的局限性，尚未推广到大多数临床实验室［15-16］。

凝胶过滤层析（GFC），利用分子筛作用和选择性洗脱，可以实现蛋白结合态和游离态的快速分离，加之凝胶载体的惰性高、吸附力弱，能够减小对内源性平衡的干扰。1979年，Romelli等［17］将凝胶过滤层析用于游离甲状腺激素测定，证实了该方法不会显著改变血清中的游离激素水平。在此基础上，本研究拟采用GFC 技术，通过进一步优化，减少样本量，简化操作步骤，建立可靠的快速前处理方法，实现高通量样本检测，使其适用于临床检测实验室。在此基础上，基于LC-MS/MS 技术建立高灵敏检测方法，以实现临床游离甲状腺激素的高灵敏、稳定、快速检测，为甲状腺激素临床相关疾病的诊断、预防、治疗、预后和监测等提供支撑。

1 实验部分

1.1 仪器与装置

LCMS-8050 CL 岛津液相色谱三重四极杆质谱仪（日本Shimadzu 公司）；PCWJ-10超纯水机（成都品成科技有限公司）；涡旋混匀仪（金坛区白塔新宝仪器厂）；QB-8002 96孔板混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BT25S 型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）；BCY9602 96 孔正压装置、BCN9602 96 孔氮吹仪（深圳逗点生物技术有限公司）；FiveEasy Plus FE28 pH 计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；平衡透析装置（北京汇智和源生物技术有限公司）。

1.2 试剂与材料

甲醇、甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；超纯水（杭州娃哈哈公司）；氢氧化钠（分析纯，成都金山化学试剂有限公司）；磷酸二氢钠二水合物和三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水磷酸氢二钠（分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司）；Proclin 300 抑菌剂、羟乙基淀粉和牛血清白蛋白（上海源叶科技有限公司）；表面活性剂Triton X-100（上海毕得医药科技股份有限公司）；纳他霉素（上海麦克林生化科技有限公司）；氯化钠（成都市科龙化工试剂厂）；Sephadex LH-20 96孔过滤板、96孔提取板、96孔收集板、96孔进样板（纳谱分析技术（苏州）有限公司）。

1.3 样 品

T3 标准品（98%，批号：21A043-C3，上海甄准生物科技有限公司）；T4 标准品（98%，批号：21A034-F6，上海甄准生物科技有限公司）；T3 内标（T3-13C12，同位素丰度为99.3%，纯度为94.2%，批号：PR-30090，青岛腾龙微波科技有限公司）；T4 内标（T4-13C6，同位素丰度 ≥ 99%，纯度 ≥ 98%，批号：22T021-T2，上海甄准生物科技有限公司）。血清样品均来自淄博市中医医院的剩余样本，样本的收集及使用已取得医院伦理委员会批准。

1.4 标准溶液和内标溶液的配制

分别准确称取T3、T4 标准品各10.0 mg，用5%氨水-甲醇溶解，并定容于10 mL 棕色容量瓶，分别配制得到质量浓度为1.0 mg/mL 的T3、T4 标准储备溶液。用30%甲醇水稀释标准储备溶液，配制得到质量浓度分别为2、4、10、20、50、100、150、200 pg/mL的系列标准工作溶液。将内标储备溶液用30%甲醇水稀释，配制得到T3-13C12、T4-13C6质量浓度均为200 pg/mL的混合内标工作溶液。

1.5 质控品的制备

准确吸取50 µL Proclin 300、50 µL 0.1 mg/mL 纳他霉素、50 µL Triton X-100，称取0.9 g 氯化钠、5.0 g 羟乙基淀粉、5.0 g 牛血清白蛋白，搅拌至完全在纯水中溶解后，使用超纯水稀释至100 mL。使用0.45 µm 滤膜对稀释后的溶液进行过滤，收集滤液，得到空白基质。将不同质量浓度的T3、T4混合标准溶液添加到空白基质中，配制得到低、中、高质量浓度（分别为10、50、150 pg/mL）的质控品。

1.6 样品前处理

Sephadex LH-20 凝胶小柱预处理：依次使用2 mL 20%乙醇水、2 mL 超纯水进行活化，再用4 mL磷酸盐缓冲液（PB，0.1 mol/L，pH 7.4）进行平衡。取150 µL血清加载至经预处理的Sephadex LH-20凝胶小柱，正压装置压入填料内，依次用4 mL Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）、150 µL甲醇进行洗涤，以去除结合蛋白的甲状腺激素，弃去洗涤液。然后用1.5 mL 甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，收集洗脱液，于室温下氮气吹干，加入150 µL混合内标工作溶液，振荡混匀2 min，待分析。

1.7 分析条件

1.7.1 色谱条件Shim-pack Velox SP-C18色谱柱（2.1 mm× 50 mm，1.8 µm）；流动相：A 相为0.002%甲酸水溶液，B 相为甲醇；流速：0.3 mL/min；柱温：45 ℃；进样量：30 µL；梯度洗脱：0～0.5 min，30% B；0.5～5 min，30%～98% B；5～7 min，98% B；7.01～9 min，98%～30% B。

1.7.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI）；数据扫描方式：正离子模式；测定方式：多反应监测（MRM）模式；脱溶剂气温度：600 ℃；加热块温度：400 ℃；接口电压：4.0 kV；雾化气流速：3.0 L/min；干燥气流速：5.0 L/min；加热气流速：15.0 L/min。各目标物的保留时间、MRM 监测离子对、碰撞电压等参数见表1。

表1 各化合物的保留时间与MRM质谱参数Table 1 Retention times and MRM mass spectrometry parameters of each compound

2 结果与讨论

2.1 分析条件的优化

2.1.1 质谱参数的优化由于羧基和氨基的存在，甲状腺激素可在正电离模式和负电离模式下检测，但实验发现T3、T4在ESI正离子采集模式下的灵敏度更高。将T3、T4、T3-13C12、T4-13C6标准溶液进行Q1母离子扫描分析，扫描范围为m/z100～1 000。分别调整脱溶剂气温度、接口电压、加热块温度、雾化气流速、干燥气流速、加热气流速等参数，使母离子响应增强，噪音降低。经过优化，T3、T4、T3-13C12、T4-13C6产生的Q1 信号最高，以稳定的［M+H］+为母离子，m/z分别为651.6、777.4、663.7、783.5。根据前体离子进行产物离子的自动优化，选择离子丰度高、干扰小且稳定的子离子作为定量离子，次强的作为定性离子。最佳的质谱参数如“1.7.2”所示。

2.1.2 色谱条件的优化考察了Waters XBridge Phenyl（2.1 mm×50 mm，5 µm）、Shim-pack GISS C18（2.1 mm×50 mm，1.9 µm）、Shim-pack Velox SP-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 µm）3 种色谱柱对目标化合物的分离效果。结果表明，Shim-pack Velox SP-C18色谱柱对目标化合物的信号响应更高，峰形更好，因此选择该色谱柱进行样品分离。分别考察了纯水、甲酸水（0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%、0.002%）、氨水（0.1%、0.01%、0.002%）、0.002%乙酸水、0.1%甲酸+2 mmol/L 乙酸铵-水溶液作为流动相A，甲醇、乙腈、50%甲醇-乙腈、0.1%甲酸+2 mmol/L 乙酸铵-甲醇溶液作为流动相B时待测物的响应强度，最终选择0.002%甲酸水溶液和甲醇作为流动相。经梯度优化，使得样品中T3 及其同分异构体反三碘甲腺原氨酸（rT3）和T4具有良好的分离效果（见图1）。

图1 T3、rT3和T4的MRM色谱图（A）与局部放大图（B）Fig.1 MRM chromatograms of T3，rT3，T4（A） and local enlarged image of A（B）

2.2 前处理条件的优化

2.2.1 尺寸排阻填料及填料量的优化考察了羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、葡聚糖凝胶Sephadex G-25、大孔树脂TOYOPEARL HW-40F、硅胶微球BioCore SEC-150 的分离性能。将凝胶溶胀，湿法装柱，SPE 凝胶小柱经过活化、平衡、上样、淋洗（1～8 管，用缓冲液洗去蛋白结合态）、洗脱（9～16管，用甲醇洗脱游离态），每管收集0.5 mL，分别进行检测，并将血清样品与标样的检测结果进行比对。以FT4为例，如图2A 所示，根据结合态与游离态的分段情况，最终选用羟丙基葡聚糖凝胶Sephadex LH-20。

图2 填料种类（A）和填料量（B）的优化结果Fig.2 Optimization results of filler type（A） and filler quantity（B）

进一步考察了Sephadex LH-20填料量分别为5、10、15、20、30、40、60、100、150 mg时的分离效果。如图2B 所示，当填料量在5～40 mg 之间时，分离得到的FT3、FT4 趋于稳定；而当填料量大于40 mg 时，分离得到的FT3、FT4 明显增多，说明部分与蛋白结合的T3、T4 发生了解离。因此，选用Sephadex LH-20填料量为15 mg，此时FT3、FT4的提取分离效果最好。

2.2.2 孵育时间及血清稀释倍数的优化为模拟体内平衡过程，考察了在37 ℃下，孵育时间分别为0、0.5、1、1.5、2 h 的影响。结果显示，随着孵育时间的延长，分离得到的FT3、FT4 含量增多，因此选择不孵育。进一步考察了血清稀释倍数分别为0、0.5、1、1.5、2 倍的影响，结果表明，随着血清稀释倍数的增加，分离得到的FT3、FT4含量增多，因此选择不稀释。

2.2.3 淋洗液的优化淋洗液主要用于洗去结合蛋白，一般用水或缓冲液。考察了Tris-HCl 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）、PB 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）、0.9% NaCl 水溶液、超纯水、PBS 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）、HEPES 缓冲液（pH 7.4）的淋洗效果。图3A 结果显示，Tris-HCl 缓冲液、PB 缓冲液、0.9% NaCl 水溶液、HEPES 缓冲液的淋洗效果相近，考虑到溶液配制过程以及实验重复性，最终选用淋洗液为Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）。

图3 淋洗液种类（A）和淋洗液体积（B）的优化结果Fig.3 Optimization results of eluent type（A） and volume（B）

考察了Tris-HCl 缓冲液（0.1 mol/L，pH 7.4）体积分别为2、4、6、8 mL 时的淋洗效果。如图3B 所示，当填料量为15 mg，上样量为150 µL 时，淋洗液体积达到4 mL 以上时提取效果较好，因此选择淋洗液体积为4 mL。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限及定量下限按“1.4”配制系列标准工作溶液，浓度从低到高依次进行检测，每个浓度水平测定3次。通过LabSolutions Ver.5.60软件进行数据处理，以标准溶液的质量浓度为X轴，标准品和内标的峰面积比值为Y轴，进行线性回归分析。结果显示，FT3、FT4 分别在2～200 pg/mL、4～200 pg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数（r2）分别为0.999 9、0.999 5。

将不同质量浓度的T3、T4 混合标准溶液添加到空白基质中，配制得到质量浓度分别为8、4、2、1 pg/mL 的样品，按“1.6”方法前处理后进行检测。分别以信噪比S/N＞3 和S/N＞10 确定方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），得到FT3、FT4的检出限分别为1、2 pg/mL，定量下限分别为2、4 pg/mL。

2.3.2 基质效应基质效应（ME）一般通过比较目标物在样品基质和空白溶剂中的信号响应进行评价。取6 个不同人体的血清样品按“1.6”方法进行提取后，分别添加低、中、高浓度（10、50、150 pg/mL）的混合标准溶液，每个浓度水平平行制备3 份，将上述样品和标准溶液进行质谱测定。参照文献方法［18］进行计算，一般认为ME 在85%～115%范围时，没有明显的基质效应影响。结果显示，FT3、FT4在低、中、高浓度的基质效应为85.8%～114%，说明没有明显的基质效应。

2.3.3 回收率按“1.5”方法制备得到低、中、高浓度的质控样品，每个浓度平行制备3 份，按“1.6”方法前处理后上机检测；同时将相同浓度的T3、T4混合标准溶液上机检测。通过比较质控样品与标准溶液的测定值，计算得到FT3和FT4的回收率分别为85.8%～103%和89.7%～107%。

2.3.4 准确度与精密度按“1.5”方法配制低、中、高3 个浓度水平的质控样品，每个浓度平行制备6 份，按“1.6”方法前处理后上机检测，得到批内准确度及批内相对标准偏差（RSD）。通过3 个分析批连续三天进行检测，得到批间准确度及批间RSD。结果显示：FT3 和FT4 的批内和批间RSD 分别为3.4%～10%和1.8%～8.8%，批内和批间准确度分别为85.4%～110%和89.1%～102%。

2.4 方法对比

将建立的凝胶过滤层析法（GFC）与平衡透析法（ED）同时用于95 例血清样本的检测。按“1.6 ”方法和ED 方法（参照CLSI C45-A 指导文件［19］）分别对血样进行前处理，然后按“1.7”仪器条件进行检测。使用IBM SPSS Statistics 26 和MedCalc 统计软件（v. 20.0.0）对检测结果进行配对t检验分析、Passing-Bablok 回归分析和Bland-Altman 一致性分析。如图4 所示，本研究建立的GFC/LC-MS/MS 法与ED/LC-MS/MS法的测定结果无统计学差异（P＞0.05），两种方法之间存在较好的一致性。

图4 凝胶过滤层析和平衡透析法测定结果的Passing-Bablok回归分析（A、C）和Bland-Altman图（B、D）Fig.4 Passing-Bablok regression analysis（A，C） and Bland-Altman diagram（B，D） of the determination results of gel filtration chromatography and equilibrium dialysis

3 结 论

本研究基于凝胶过滤层析进行前处理，结合LC-MS/MS 分析，建立了血清中游离甲状腺激素FT3和FT4的高通量、高灵敏检测新方法。将该方法应用于95例血清样本的检测，结果与平衡透析法存在较好的一致性。本方法快速（5 h）、简便，受干扰因素相对较少，更便于临床推广。该方法可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考。