韩金治，李亚茹，罗 林，关 甜，雷红涛，蔡伟谊，2，王炳志，徐振林*

（1.广东省食品质量安全重点实验室，华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642；2.广州市食品检验所，广东 广州 510410；3.深圳市易瑞生物技术股份有限公司，广东 深圳 518000）

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一种低分子量的非蛋白类神经毒素，广泛存在于鲀科鱼体表及体内脏器中［1］，近年来在织纹螺、蓝环章鱼、海星等生物体内也检测到TTX 的存在［2-4］。TTX 最早于20世纪初由日本化学家田原良纯率先在河豚中发现［5］，被认为是海洋中最致命的毒素之一［6］。它通过选择性阻断神经、骨骼肌和心肌膜的电压门控Na+通道的动作电位而起作用［7］，小鼠腹腔注射的半致死剂量（LD50）为10.7 µg/kg［8］。据报道，等量的TTX 的毒性为氰化物的数万倍，对人体的致死剂量仅为0.5 mg［9］。由于TTX具有热稳定性［5，8］，因此在一般的烹饪过程不会被破坏［10］。全球因食用水产品造成的河豚毒素中毒案例频发［11-18］，除日本外，中国为全球河豚毒素中毒事件数量最多的国家（图1［11］）。2016～2022 年广东省卫生健康委员会相继发布多起河豚毒素中毒事件（http：//wsjkw.gd.gov.cn/）。因此建立一种简便、快速、灵敏、低成本的检测方法对于防止河豚毒素中毒及中毒后的快速诊断都十分必要。

图1 全球地图-各国的病例分布Fig.1 Global map reporting the distribution per country of the cases included in the present study

目前，河豚毒素的检测方法有生物检测法［19］、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）［20］、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）［21］、酶联免疫法（ELISA）［22］、生物传感器法［23-26］等。但生物检测法存在个体差异；仪器分析法需要精密仪器以及专业人员，样品前处理步骤复杂［27］；生物传感器信号放大功能有限，且信号输出不稳定，重现性差。以上不足使这些方法在现场快速检测方面受到一定的局限，难以满足市场应用的需求。相比于上述几种方法，纸基的免疫层析方法具有简单快速、特异性强、检测时间短且成本低的优势［28］，根据示踪物［29］的不同可将其分为荧光免疫层析法、量子点免疫层析法、胶体金免疫层析法等。其中胶体金免疫层析技术因价格低廉、操作简单、结果可视化等优点被广泛运用于食品安全、环境监控、临床诊断等领域［30-34］。早期Ling 等［35］利用实验室获得的高特异性河豚毒素单克隆抗体建立了一种检出限为20 ng/mL 的胶体金免疫层析方法。Zhou 等［36］基于河豚毒素单克隆抗体并以TTX-BSA 为包被抗原制备了一种河豚毒素胶体金免疫层析试纸条，其可视化的检出限为40 ng/mL。本课题组前期通过改良制备了抗河豚毒素的单克隆抗体，并构建了免疫传感器［24］，虽然该法灵敏度很高，但实用性仍有待提高。

为了弥补国内当前河豚毒素商业化试纸条的空白，本研究基于前期制备的抗体，通过标记胶体金建立了免疫层析法，并系统对影响胶体金免疫层析法检测性能和稳定性的条件以及样品前处理方法进行优化，最后用于河豚鱼、织纹螺等实际样品的检测。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

样品垫、硝酸纤维膜（NC 膜）、吸水垫和聚氯乙烯底板（PVC 底板）（上海金标生物技术有限公司）；样品垫处理液、金标复溶液（广州万联生物科技有限公司）；氯金酸、柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司）；羊抗鼠IgG（北京全式金生物有限公司）；河豚毒素标准品（成都曼斯特生物科技有限公司）；河豚毒素包被原、抗河豚毒素单克隆抗体，均为实验室自制；其余试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

HGS510 划膜仪、HGS201 裁条机、GIC-Q 金标读数仪（杭州峰航科技有限公司）；低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；MS旋涡振荡器（德国IKA 公司）；SKFG-01烘箱（湖北黄石市恒丰医疗机械有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 胶体金的制备与鉴定

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒［37］。称量100.0 mL一级水于干净的圆底烧瓶中，置于磁力搅拌油浴锅中（180 ℃，700 r/min）搅拌加热回流至煮沸，加入4.0 mL 10.0 g/L的氯金酸溶液，持续加热搅拌至再次沸腾，迅速加入4.6 mL 10.0 g/L 的柠檬酸三钠溶液，持续搅拌至溶液颜色变成透亮的酒红色，再搅拌10 min停止加热，继续搅拌5 min，冷却至室温，于4 ℃保存备用。

通过紫外扫描对胶体金进行表征：对制备的胶体金溶液进行紫外-可见分光光度计全光谱扫描，获得胶体金溶液在可见光区（400～650 nm）的吸收光谱，记录其最大吸收峰的波长，并根据线性方程Y=0.786X+505.53计算胶体金的粒径大小，其中Y为最大吸收波长（nm），X为胶体金粒径大小（nm）［38］。

1.3.2 单克隆抗体-胶体金标记物的制备

取1 mL 制备好的胶体金溶液于离心管中，加入适量0.1 mol/L K2CO3溶液并振荡混匀，使体系pH值达到蛋白质等电点以确保抗体与纳米金颗粒形成牢固化合物［39］。随后向离心管中加入定量抗体室温孵育5 min 后，加入10 µL 100.0 g/L 牛血清白蛋白溶液（BSA）封闭未结合位点，室温下孵育20 min。最后在4 ℃条件下12 000 r/min 离心15 min，弃上清，加入1.0 mL 金标复溶液使红色沉淀物复溶并混匀，将其包被在96孔酶标板中，包被体积为15 µL，45 ℃过夜烘干，待用。

1.3.3 胶体金免疫层析法的建立

1.3.3.1 试纸条的制备及组装 免疫层析试纸条分别由4部分组成，将吸水垫、硝酸纤维素膜以及样品垫按照从上至下的顺序依次交叠粘贴于聚氯乙烯底板上。硝酸纤维素膜上利用划膜仪分别喷涂用0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释至适合浓度的抗原和羊抗鼠IgG 作为检测线（T 线）和质控线（C 线），45 ℃干燥箱中静置过夜，待用。另外将玻璃纤维素膜（预先切割成22 mm 宽）在样品垫处理液中浸泡10 min，取出后于45 ℃下过夜烘干，待用。

1.3.3.2 检测步骤及原理 取100.0 µL 标准溶液或样品提取液加入提前制备好的金标微孔中充分混匀，反应3 min 后，将微孔内的所有溶液吸出，滴加至试纸条的样品垫上反应5 min。将含有待测物的溶液滴加在样品垫上作为流动相，溶液在毛细管作用下沿着吸水纸方向移动。当样品中无待测物质时，金标抗体与硝酸纤维素膜上固定化的抗原发生特异性结合，检测T 线因标记物积累而显色。当样品中含有待测物质时，其与T 线上的抗原竞争结合抗体，从而使T 线显色减弱或不显色。无论样品中是否含有待测物质，C线上喷涂的羊抗鼠IgG都会与金标抗体结合进行显色，若不显色则证明试纸条无效。

1.3.4 胶体金免疫层析法检测条件的优化

为达到最佳的试纸条检测灵敏度、稳定性以及色彩强度，研究并优化了胶体金体系的pH值、抗原抗体用量、离子浓度、表面活性剂种类以及样品前处理方法等影响胶体金层析卡性能的条件。为筛选最佳条件，利用胶体金读数仪对试纸条进行扫描，得到T 线和C 线的信号值。抑制率按公式：抑制率（%）=（B0-BX）/BX×100计算，其中，BX为阳性样品T线和C 线信号强度比值，B0为阴性样品T线和C 线信号强度比值。

1.3.5 试纸条的性能评价

1.3.5.1 灵敏度 胶体金免疫层析法不仅可以对目标分析物进行定性检测，还可以利用胶体金读取仪进行定量检测。定性检测时，裸眼消线值（Cut-off）为定性检出限，即引起T 线颜色消失的最低分析物浓度。在上述优化条件下，使用0.01 mol/L 磷酸缓冲溶液配制系列标准品溶液（0、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0 ng/mL），定量分析时，用读数仪读取各试纸条的T 与C 值，以检测样本与阴性样本检测线信号值的比值（B/B0）为纵坐标，河豚毒素浓度的对数值为横坐标绘制散点图，用Origin S 型曲线拟合后得标准曲线和线性方程。根据线性方程可计算出半抑制浓度IC50（B/B0=0.5时的药物浓度）用于评估试纸条灵敏度和检出限IC10（B/B0=0.9时的药物浓度），同时通过相关数（r2）判断线性方程的拟合度。

1.3.5.2 实际样品检测 样品前处理：选取2 g 匀浆后的阴性样本于50 mL 离心管中，加入2 mL 提取剂，涡旋振荡2 min后于4 000 r/min离心10 min，吸取100 µL上清液稀释数倍后即得到提取液。为保证样品提取效率并简化前处理流程，消除基质效应，对提取剂种类、提取液稀释倍数进行优化。

选择河豚、织纹螺两种阴性样品进行河豚毒素加标回收实验。向样本中添加河豚毒素使其最终含量为44、70、100 ng/g，在优化的前处理方法下进行提取，每一含量设置3个平行，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。

2 结果与讨论

2.1 胶体金的表征

胶体金免疫层析分析方法（GICA）检测信号的大小与胶体金颗粒大小有关，直径在20 nm 以下会出现显色过浅的现象，但粒径过大则会产生空间位阻效应。胶体金免疫层析法常用的粒径大小为20～40 nm［35］，该区间的金粒子显橙红色且稳定性强。由图2A 可知，制备的胶体金的最大吸收波长为531 nm，此时吸光度值为OD531=1.6 486。根据“1.3.1部分”公式计算，可得到胶体金的粒径大小约32 nm。电镜图（图2B）显示，胶体金颗粒分布均匀。

图2 胶体金溶液鉴定结果Fig.2 Identification result of colloidal gold

2.2 胶体金免疫层析条件优化

2.2.1 标记pH值及抗体浓度的优化

胶体金颗粒对蛋白质的吸附程度主要取决于溶液的pH值，在接近蛋白质等电点或偏碱条件下，二者容易形成牢固的结合物［36］。若pH值偏低会破坏胶体金表面的静电荷，导致胶体金自身共聚，发生变色，静置后产生肉眼可见的颗粒性沉淀；而pH值偏高时，金粒子与抗体间的作用力不足，吸附蛋白量少，制得的试纸条的检测显色明显减弱，灵敏度显著降低［37］。胶体金体系pH值一般通过控制标记过程中K2CO3溶液的体积来调节。本文采用0.1 mol/L K2CO3溶液对体系pH值进行优化。将1 mL胶体金溶液加入到经超纯水润洗后的1.5 mL 离心管中，向其中分别加入不同体积的0.1 mol/L K2CO3，其余操作步骤同“1.3.2”。相同参数条件下，向阴性试纸条中加入100 µL不含待测物的磷酸缓冲液，向阳性试纸条中加入100 µL 5 ng/mL 河豚毒素，进行两组平行实验。结果显示，当K2CO3溶液体积从8 µL 增加到20 µL 时，试纸条的T、C 线颜色明显加深，继续增加K2CO3溶液体积，试纸条T、C 线的颜色变浅，K2CO3溶液体积为20 µL 时试纸条的抑制率最高（图3A），且T、C 线颜色最深。因此K2CO3溶液体积为20 µL时，该试纸条灵敏度最高，显色情况最好。

图3 不同反应条件对GICA性能的影响Fig.3 Effects of different reaction conditions on GICA performance

标记抗体用量是影响试纸条性能的重要因素。当标记抗体量过多时，会出现游离抗体与已结合抗体共同竞争待测物质，导致试纸条出现假阴性；还会出现检测线颜色过深且拖尾，造成抗体浪费。当标记抗体量过少时，则胶体金标记不完全，导致试纸条T、C线颜色过浅造成误判。因此在上述最优的K2CO3溶液加入量基础上，分别添加不同体积抗体进行优化，其中河豚毒素抗体的质量浓度为7.8 mg/mL。结果显示，在最适pH 值下，随着标记的抗体浓度逐渐升高，试纸条阴性T 线显色逐渐增强，当标记抗体为5、6 µL 时，试纸条颜色满足后续检测要求，且抗体为5 µL 时具有更高的抑制率（图3B）；抗体添加量为7 µL时虽然抑制率高，但显色与5 µL时相差不大。故确定5 µL为最优的抗体标记体积。

2.2.2 T线与C线包被浓度优化

在达到最佳pH 值和抗体标记体积条件后，为使试纸条获得最佳显色效果，需对T线和C 线的浓度进行优化。包被在NC膜上的T线抗原浓度会影响其与抗体的反应，进而影响试纸条显色强弱。抗原浓度高会加深T 线显色导致灵敏度下降，反之抗原浓度低时T 线显色较弱，造成实验结果误判且难以通过肉眼进行定性检测。结果显示，随着抗原浓度升高，T 线颜色逐渐变深，当T 线质量浓度为0.2 mg/mL时，继续增加抗原用量T线颜色无明显变化且灵敏度降低（图3C），说明结合趋于饱和，故选择灵敏度最高的0.1 mg/mL为最佳T线包被浓度。

以C 线喷涂羊抗鼠IgG 作为质量控制线，根据其显色情况可判断试纸条是否有效，因此在最佳抗原浓度下，需对C线包被浓度进行优化。结果显示，随着二抗浓度的增加，试纸条C线颜色逐渐变深，但抑制率逐渐下降，当包被质量浓度为0.05 mg/mL 时，显色过浅且T/C 值过高（图3D）；包被质量浓度为0.2 mg/mL时，T/C值在1.0～1.5之间，C线显色度适中且灵敏度较好。故选择0.2 mg/mL为最佳C线包被浓度。

2.2.3 稀释液种类与离子浓度的优化

稀释液对标品待测液具有良好的缓冲效果，同时还具有很好的盐平衡能力。缓冲溶液中不同的离子种类会对试纸条性能及抗原抗体结合效率产生一定影响。选择常见缓冲剂为药物稀释液进行优化。结果显示，稀释液为磷酸盐缓冲溶液（PBS）和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（CAB）时，抑制率高，但显色过浅，不适用于后续检测；硼酸缓冲溶液（BB）作为稀释液时，试纸条T 线不显色且抑制率过低（图4A）。而磷酸缓冲溶液（PB）则表现出良好的显色效果和灵敏度，故选择PB为最佳稀释液。

图4 稀释液种类（A）及其离子浓度（B）对GICA性能的影响Fig.4 Effects of diluent type（A） and its concentration（B） on the GICA performance

稀释液离子浓度也会影响抗原抗体反应活性及药物与抗体的反应效率。结果显示，随着稀释液离子浓度的降低，试纸条显色无明显变化，阴性T/C 值及抑制率均不断升高，且在PB 缓冲液离子浓度为0.0 125 mol/L 时抑制率达到最高（图4B）。但由于缓冲液中离子浓度过低时缓冲效果欠佳，达不到良好的基质消除效果，不适用于后续的样品处理。故选择0.1～0.025 mol/L 的PB 缓冲液稀释液用于后续实验。

2.2.4 样品垫缓冲液种类与蔗糖浓度及表面活性剂浓度优化

样品垫的缓冲体系不仅影响抗原抗体在NC膜上的结合，还对待测液起到一定的缓冲作用，因此探究了PB、PBS、BB、Tris-HCl等几种常用溶液作为样品垫缓冲液对试纸条检测性能的影响。图5A结果显示，当PB 为缓冲液时，抗原抗体的结合受到较大影响，试纸条显色不明显。缓冲液为PBS、BB、Tris-HCl 时，试纸条显色强度明显提升，且PBS 抑制率最高，显色明显。因此，选择PBS 为样品垫缓冲液。

图5 样品垫不同配方对GICA性能的影响Fig.5 Effects of different formulations of sample pads on the GICA performance

一定含量的小分子物质如蔗糖、海藻糖、甘油等有利于胶体金溶液的稳定性，通过向样品垫处理液中加入不同含量的蔗糖考察其对试纸条性能的影响。结果表明，在同一检测条件下，不添加蔗糖显色很淡，随着蔗糖含量的增大，试纸条显色逐渐加深，抑制率也逐渐升高，当蔗糖含量达1%后，进一步增加其含量试纸条颜色无变化（图5B），故选择样品垫中最优蔗糖含量为1%。

大分子物质作为胶体金探针的骨架，可起到稳定体系的作用，因此对样品垫上的表面活性剂含量进行优化。当向样品垫处理液中添加不同含量的聚乙烯基吡咯烷酮（PVP-40）时，试纸条显色强度及灵敏度均明显下降，且样品垫中添加表面活性剂时，T、C线均显色较浅（图5C）。故选择样品垫中不添加表面活性剂。

2.3 样品前处理优化

在实际样品检测中，基质效应会极大影响结果的准确性，导致实际回收率结果不理想。因此对样品的前处理方法进行优化，以提高回收率、缩短前处理时间，实现快速检测。河豚、织纹螺两种阴性样本经搅碎匀浆后，以3 种提取剂进行提取，通过稀释不同倍数消除样品基质效应及提取试剂对体系的影响，建立该条件下的样品标准曲线，并通过与缓冲液体系下的标准曲线进行对比，确定最佳前处理方法，以获得更高的灵敏度及准确度。

2.3.1 提取溶剂优化

基于河豚毒素微溶于水，易溶于稀酸的特性，对比了0.1 mol/L PB 缓冲液、3%对甲苯磺酸（TsOH）和1%乙酸（HAc）3种提取剂的效果。结果显示，乙酸提取时T、C线显色均不明显，因此乙酸不适用于样品的提取。使用对甲苯磺酸提取时得到的标准曲线与PBS所得曲线的形状及IC50值最为接近（图6A）。因此，最终选取对甲苯磺酸作为提取溶剂。

图6 前处理方式对GICA性能的影响Fig.6 Effect of pretreatment method on GICA performance

2.3.2 稀释倍数优化

对TsOH的稀释倍数进行优化。图6B结果显示，随着稀释倍数从10倍提高到20倍，所得到的标准曲线的IC50越来越接近稀释液的IC50，即可减少基质效应影响并提高最终回收率。故最终确定稀释倍数为20倍。

2.4 试纸条性能评价

2.4.1 灵敏度

在上述优化条件下进行实验，以TTX 的质量浓度和试纸条检测结果绘制标准曲线。当 TTX 为12.0 ng/mL 时，胶体金试纸条检测线条带完全消失，因此该试纸条检测TTX 的裸眼消线值为12.0 ng/mL。通过结果拟合，本研究所建立方法的检出限为0.5 ng/mL，IC50为 3.2 ng/mL（图7A）。在0.8～10.6 ng/mL TTX 质量浓度范围内，所建立的GICA 方法对 TTX 检测具有良好的线性关系，线性回归方程为Y=0.69-0.47X（r2=0.998）（图7B），式中Y为检测样本与阴性样本检测线信号值的比值（B/B0），X为河豚毒素质量浓度的对数值。

图7 GICA性能评价Fig.7 Performance evaluation of the GICA

2.4.2 实际样品检测

选择河豚、织纹螺两种阴性样品进行加标回收实验。河豚毒素的加标水平分别为44、70、100 ng/g，每个水平设3个平行。在优化的前处理条件下，所得结果如表1所示，样品的加标回收率为70.5%～110%，RSD 为3.7%～7.1%，检测结果与LC-MS/MS 法一致（图7C）。与文献中河豚毒素的检测方法进行对比（表2），结果表明本研究建立的免疫层析法不仅灵敏度高，且操作简便、成本低，能满足市场的大批量筛查需求。

表1 样品加标回收检测结果（n=3）Table 1 Recoveries of spiked samples（n=3）

表2 河豚毒素检测方法对比Table 2 Comparison of the analytical methods for TTX

2.4.3 试纸条稳定性

在50 ℃ 下进行加速稳定性实验，利用高温环境模拟验证试纸条的稳定性，不同时间后试纸条的性能变化如图7D所示。结果表明，加速实验7、14、28天后，试纸条的各项性能均保持良好稳定性。

3 结 论

本研究基于实验室自制的河豚毒素单克隆抗体构建了胶体金免疫层析检测方法，实现了河豚毒素的快速定量检测。方法检出限为0.5 ng/mL，IC50为3.2 ng/mL，线性范围为0.8 ～10.6 ng/mL。河豚和织纹螺样品的加标回收率分别为75.0%～90.5%和70.5%～110%。本研究建立的免疫分析方法适用于水产品中河豚毒素的现场快速筛查，可作为风险监测和预警手段用于实际监管。