张 涵,华文静,李文洁,闫 满,沙万里

(吉林农业科技学院动物科技学院,吉林 吉林 132109)

近年来,关于气球菌致病的报道日益增多,该类菌属广泛存在于土壤、空气、植物和医疗环境中。目前,已确定的气球菌属包括绿色气球菌(Aerococcusviridans)、脲气球菌(Aerococcusurinae)、人脲气球菌(Aerococcusurinaehominis)、血气球菌(Aerococcussanguinicola)、柯氏气球菌(Aerococcuschristensenii)、猪气球菌(Aerococcussuis)、马脲气球菌(Aerococcusurinaeequi)和阴道气球菌(Aerococcusvaginalis)共8个不同菌种[1]。其中,绿色气球菌可感染人类和动物[2,3];人脲气球菌和脲气球菌在老年人的尿道中被证实与尿路感染有关[4,5];柯氏气球菌在人血中被证实与人类心肌内膜炎有关[6];血气球菌在人阴道中被证实与人类阴道炎有关[7];猪气球菌在猪脑中被证实与猪脑膜炎有关[8];阴道气球菌在奶牛阴道中被证实与奶牛阴道炎有关[9]。

根据目前的国内外报道,马脲气球菌曾经在患足趾炎的蛋鸡、牛的冻乳和猪的尿液中被发现[10-12]。2016年,Zhou等[13]在1名慢性肾病患者的腹水中分离出马脲气球菌,确定了该菌对人类具有致病性。目前尚未见犬感染马脲气球菌的研究报道。本试验从临床患尿道感染的母犬尿道中分离到1株马脲气球菌,并对其生物学特性和药物敏感性进行初步研究,以期对马脲气球菌病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料来源 吉林省某犬舍患有尿道炎母犬的尿道拭子,母犬表现为尿频,尿道出现白色脓性分泌物,精神沉郁。

1.2 主要试剂 脑心浸出液琼脂(Brain heart infusion agar,BHIA)培养基、水解酪蛋白琼脂(Mueller hinton,MH)培养基和脑心浸出液肉汤(Brian heart infusion,BHI)培养基,均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒和50×TAE缓冲液,均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;PremixTaq(ExTaqVersion),购自TaKaRa Biotechnology;微量生化管和药敏纸片,均购自杭州微生物试剂有限公司;核酸染料和革兰染色试剂,均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 主要仪器 超净工作台和PCR仪,均购自赛默飞世尔科技公司;恒温气浴振荡器,购自上海博讯医疗生物仪器股份有限公司;高速离心机,购自盐城市凯特实验仪器有限公司;凝胶成像仪,购自伯乐生命医学产品公司。

1.4 细菌的分离培养 将采集的尿道拭子接种于BHIA培养基,37 ℃需氧培养12 h后进行分离纯化培养,镜检至细菌形态单一后命名为ZH-4,将ZH-4接种于BHI培养基中培养12 h,备用。

1.5 染色镜检 载玻片用酒精擦拭后,挑取单菌落用无菌生理盐水稀释,在酒精灯外焰加热固定,革兰染色法染色,油镜下观察细菌形态。

1.6 生化试验 挑取纯化培养后的ZH-4接种于微量生化管,37 ℃培养18 h,操作过程和结果判定参照微量生化管说明书和《伯杰细菌鉴定手册》第8版。

1.7 16S rRNA基因序列测定 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取ZH-4的DNA,PCR扩增引物为细菌16S rRNA通用引物[14],引物序列为:16S rRNA-F:5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,16S rRNA-R:5′-AG-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3′,引物由库美生物科技有限公司合成。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,其切胶纯化产物送往生工生物工程(长春)股份有限公司测序。

1.8 系统进化分析 分离菌株ZH-4的16S rRNA基因测序结果与GenBank数据库中已知的不同种的细菌基因核苷酸序列进行BLAST比对分析,并用DNASTRA 11.0软件构建系统进化树。

1.9 药敏试验 采用常规纸片法检测ZH-4对头孢噻肟(Cefotaxime)、克林霉素(Clindamycin)、氯霉素(Chloroamphenicol)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、阿奇霉素(Azithromycin)、红霉素(Erythromycin)、磺胺异噁唑(Sulfaisoxazole)、复方新诺明(Trimethoprim)、庆大霉素(Gentamicin)、青霉素(Penicillin)、苯唑西林(Oxacillin)、万古霉素(Vancomycin)、多西环素(Deoxytetracycline)、四环素(Tetracycline)和阿莫西林(Amoxicillin)共15种抗菌药物的药物敏感性。结果判定参照药敏纸片说明书。

2 结果

2.1 细菌的分离培养和染色镜检 将菌液涂布于BHIA培养基上,37 ℃恒温培养12 h后进行观察,可见菌落特征为白色的圆形突起,并且表面光滑。革兰染色结果显示,分离菌株为革兰阳性菌,形态为成对、四联状球菌(图1)。

图1 菌株ZH-4的菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain ZH-4A:菌落形态观察; B:革兰染色(1 000×)A:Colony morphology observation; B: Gram staining (1 000×)

2.2 生化试验 结果如表1所示,ZH-4对木糖、乳糖和蔗糖呈阴性,对海藻糖呈阳性,这与其他马脲气球菌的生化特性相同,但却可以发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露醇,与其他马脲气球菌生化特性不同。

表1 菌株ZH-4生化试验结果Table 1 Biochemical test results of strain ZH-4

2.3 16S rRNA基因序列测定 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示,可得到1条大小为1 468 bp的条带,与目的条带大小相符。测序结果与NCBI数据库进行序列比对,该分离菌株与马脲气球菌相似性为97.99%,证实其为马脲气球菌。

图2 马脲气球菌16S rRNA基因PCR扩增Fig.2 PCR amplification of 16S rRNA gene in Aerococcus urinaeequiM:DNA分子质量标准; 1:马脲气球菌 16S rRNA的PCR扩增产物M:DNA molecular weight Marker; 1:PCR product of Aerococcus urinaeequi 16S rRNA

2.4 系统进化分析 系统进化树如图3所示,分离菌株ZH-4与其他同属的6株马脲气球菌亲缘关系较低,可能由于其他6株马脲气球菌均为人源(图3)。

图3 ZH-4菌株与其他马脲气球菌16S rRNA基因的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA genes of ZH-4 strain and other Aerococcus urinaeequi▲:本试验所得分离菌株▲:The strain isolated in this study

2.5 药敏试验 结果如表2所示,ZH-4对头孢噻肟、克林霉素、氯霉素、环丙沙星、阿奇霉素、红霉素、磺胺异噁唑、复方新诺明、庆大霉素、青霉素、苯唑西林和万古霉素均耐药,对多西环素和四环素敏感。

表2 ZH-4菌株药敏试验结果Table 2 Drug sensitivity test results of strain ZH-4

3 讨论

气球菌病是一种常见的人兽共患病,其病原气球菌作为一种条件致病菌,在开放性外伤、免疫功能低下的情况下,可能会引起菌血症、败血症、败血型关节炎和心内膜炎等疾病。气球菌中绿色气球菌较为常见,易引发多种动物发生疾病,也出现过人畜相互传染的报道。对于马脲气球菌,虽然尚未有人畜间传播的病例,但仍需警惕该病菌的传播。此外,由于目前对马脲气球菌的了解较少,对其可能导致患病的部位也难以确定。Heidemann等[10]曾在患有足趾炎的蛋鸡中分离出1株马脲气球菌;Júnior等[11]曾在冷冻生乳中发现过马脲气球菌。由此可见,需要尽早对马脲气球菌采取有效的防治措施。

本试验从采集的犬尿道拭子中分离得到菌株ZH-4,通过对菌落进行细菌形态、生化试验、16S rRNA序列测定和系统进化分析,鉴定分离菌株ZH-4为马脲气球菌;药敏试验结果显示,ZH-4对四环素和多西环素敏感。但Yang 等[12]在2021年分离获得的马脲气球菌对四环素表现出较强的耐药性,并通过全基因组测序发现其有2个新的四环素抗性基因——tet(58)和tet(61)。本药敏试验结果显示,马脲气球菌ZH-4对万古霉素和红霉素耐药,这与Zhou等[13]在1名慢性肾病患者的腹水中分离获得的马脲气球菌的耐药情况相同。此外,ZH-4作为首次在犬尿道拭子中发现的马脲气球菌,其在药敏试验中也表现出了对头孢噻肟、克林霉素和氯霉素等多达12种抗菌药物具有较强的耐药性,对四环素和多西环素表现敏感。本试验首次从犬尿道分离到马脲气球菌,并对其进行基本生物学特性分析,为该细菌所致犬尿道炎的临床诊疗提供理论依据。