刘雨彤,黄勇,毛洪运,张童,崔杰,李梦雨,候蓉,郑云枫,华永庆,4

(1.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心,南京 210023;2.南京中医药大学药学院,南京 210023;3.贵州广济堂健康药业有限公司,贵阳 550000;4.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,南京 210023)

鹿胶为鹿科动物马鹿C.elaphus及梅花鹿C.nippon的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。鹿胶作为补益药使用已有千年历史,早在《神农本草经》中就称之为上品。《本草纲目》中记载鹿 皮“补气;涩精;敛疮”。《四川中药志》中记载鹿皮“能补气,涩虚滑。治妇女白带,血崩不止,肾虚滑精;涂一切疮”。《北京市中药炮制规范》中描述“鹿皮胶味咸,性温,归肝、肾经,补气,涩虚精,强筋健骨”。《贵州省中药、民族药饮片标准》中叙述“鹿皮胶性偏于温,既能补阳,又可滋阴补血、止血,同样适用于血虚证、出血证”。

鹿皮在历史记载中皆为上等之品,其资源有限,使得其逐渐退出熬胶主流原料的舞台[1]。近年来随着鹿养殖业的蓬勃发展[2],鹿皮、鹿角、鹿血等多种鹿制品重新走入大众视野。基于传统用法,鹿胶的应用最为广泛。研究表明,鹿胶可改善多种血虚动物模型的血虚症状[3-4]。目前对于采用驴皮熬制的阿胶的研究较为丰富,提高免疫力、补血止血和抗疲劳[5]、抗衰老[6]等作用被普遍认可。而传统认为更为名贵的胶类中药鹿胶,其是否具有类似的补益作用,以及是否更具特点仍缺乏研究支撑。

斑马鱼自20世纪90年代引入我国实验室,现已成为研究中药整体功效的新兴模式生物之一。斑马鱼具有个体小、易饲养、生殖能力强等特点,与人类基因的相似度可达70%[7],且斑马鱼的血液、骨骼等系统及生理功能方面与人体存在众多共同特点。基于斑马鱼造模方便、易于观察等特点,本研究采用斑马鱼疾病模型对鹿皮胶的补血、抗骨质疏松和抗衰老作用进行探索,为鹿胶的应用提供支撑。

1 材料与方法

1.1实验动物与仪器试剂

1.1.1实验动物 3个月龄斑马鱼AB品系,购自于南京尧顺禹生物技术有限公司。斑马鱼饲养条件:昼夜节律为昼：夜=14 h：10 h;温度(28±0.5)℃。饲养环境严格按照《江苏省地方标准 实验用斑马鱼饲育技术条件》。实验流程严格按照《实验动物管理与使用指南》执行。斑马鱼适应性饲养3 d后可以交配产卵,产卵当天收集斑马鱼受精卵。

1.1.2仪器与试剂 鹿胶,批号:2018103,购自贵州广济堂药业有限公司;阿胶,批号:1510012,购自山东东阿阿胶股份有限公司;草甘膦(glyphosate,Gly),批号:20200317B,购自山东三农生物科技有限公司;Bcl-2抗体,货号:ab32124,购自Abcam公司;GAPDH,货号:10494-1-P,购自美国proteiontech;动物基因组DNA快速抽提试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,货号:D0065S、P0015L,购自上海碧云天生物有限公司;中性树脂,批号:70120150,Biosharp;链霉蛋白酶E,批号:721J041,购自北京索莱宝科技有限公司;二甲亚砜(dinethylsulfoxide,DMSO),批号:C12804515,购自上海麦克林生化科技有限公司;泼尼松龙(prednisolone,Pred)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、吖啶橙、甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、钙黄绿素,批号:T20J7H9291、S51140、R20290、A12D11H134386、K22A9C68341,均购自上海源叶生物有限公司;RNA isolater Tolal RNA Extraction Reagent、HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)、AceQ®qPCR SYBR Green Master Mix,货号:R401-01-AA、R223-01、Q111-02,均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

斑马鱼循环养殖系统(型号:ZF-104),南京一树梨花生物科技有限公司;人工气候培养箱(型号:RGL-P160B),合肥达斯卡特生物科技有限公司;体视荧光显微镜(型号:M205FA),德国Leica公司;实时荧光定量PCR仪(型号:QuantStudio 6 Flex),Applied Biosystems;多功能酶标仪(型号:Synergy2),Bio-Tek;台式冷冻离心机(型号:54178),eppendorf公司;电泳仪(型号:mini-protean powerpack basic)、数字化凝胶成像工作站(型号:ChemiDocTMXRS+),美国BIO-RAD公司。

1.2实验方法

1.2.1分组及给药 Gly诱导斑马鱼红细胞异常实验使用3月龄成鱼,分为6组:空白对照组、模型对照组(100 μmol·L-1Gly)、阿胶组(0.1 mg·mL-1)和鹿胶小、中、大剂量组(0.05、0.1、0.2 mg·mL-1),每组10尾。实验前2 d停止喂食,模型对照组予以模拟海水配置的100 μmol·L-1Gly溶液,各药物组在予以Gly造模的同时给与药物,给药48 h。

MTX诱导斑马鱼幼鱼造血异常实验使用2 dpf斑马鱼,组别设置与Gly实验相同,模型对照组给予600 μg·mL-1MTX,每组20尾,给药组在给予模型药的同时给予对应浓度的药物,给药24 h。

Pred诱导斑马鱼骨形成抑制实验使用健康的3 dpf斑马鱼,分为6组:空白对照组(0.2%DMSO)、模型对照组(25 μmol·L-1Pred)、阿胶组(0.04 mg·mL-1)、鹿胶小、中、大剂量组(0.01、0.02、0.04 mg·mL-1),置于6孔板中,每孔给予3 mL培养基。从3 dpf开始,空白对照组换为含有0.2%DMSO的胚胎培养基,模型对照组及其他给药组换为含0.2%DMSO的25 μmol·L-1Pred的胚胎培养基。从5 dpf开始给药,空白对照组和模型对照组继续给予对应的胚胎培养基不变,各给药组在给予模型药的同时给予对应浓度的药物。每天半数换液,连续给药4 d。

DBP诱导斑马鱼眼部细胞凋亡实验选取健康的30 hpf斑马鱼胚胎,随机分为6组:空白对照组、模型对照组(10 μmol·L-1DBP)、阿胶组(0.5 mg·mL-1)、鹿胶小、中、大剂量组(0.02、0.1、0.5 mg·mL-1),每组20尾。模型对照组给予10 μmol·L-1DBP,各给药组在给予DBP的基础上分别给予对应浓度的药物,置于6孔板中,体系3 mL,培养18 h。

1.2.2姬姆萨染色实验 斑马鱼成鱼经给药后,麻醉断尾取血。斑马鱼尾鳍向前约1/6处剪断,将血迅速在玻片上推开,甲醇固定5 min。固定结束后,倾去甲醇,姬姆萨染色15 min,三蒸水冲洗30 s。载玻片自然风干后,中性树脂封片,显微镜下观察斑马鱼红细胞形态。

1.2.3钙黄绿素染色实验 将9 dpf的斑马鱼置于培养基中静置1 h,0.2%钙黄绿素(pH值=7)溶液避光孵育1 h,培养基漂洗3次,再次静置1 h。用0.04 g·L-1三卡因对斑马鱼进行麻醉,于体视荧光显微镜下成像。

1.2.4吖啶橙染色实验 给药18 h后,吸尽胚胎培养基,加入0.5 g·L-1链酶蛋白酶E溶液置于人工气候箱中脱膜15 min。当观察到胚胎多数已脱去其卵膜时,加入胚胎培养液终止脱膜。漂洗2次,吸尽胚胎培养液,给予5 mg·L-1的AO染色溶液避光染色1 h。染色结束后漂洗3次,用0.04 g·L-1MS-222麻醉胚胎5 min,吸取幼鱼置于载玻片中央,于体视荧光显微镜下观察凋亡眼部细胞并摄相。

1.2.5qRT-PCR检测实验 使用Trizol提取RNA,经逆转录反应合成cDNA。按照试剂盒说明书,构成20 μL反应体系进行qPCR反应。反应结束后以GAPDH作为内参,按照2-相对定量计算公式得到相对定量结果。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6Western blotging检测实验 给药18 h后,脱膜并提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,加入SDS-PAGE上样缓冲液变性。使用10%PAGE胶电泳分离蛋白,分离后的蛋白转印到PVDF膜上,5%BSA封闭1 h,加入Bcl-2和GAPDH抗体孵育过夜,HRP标记的二抗室温孵育1 h,ECL发光法显影成像。

1.2.7图片采集及数据处理 Gly实验采用明美软件进行图片采集,钙黄绿素染色实验和吖啶橙染色实验采用徕卡显微镜成像软件进行采集图像。利用Image Pro Plus软件对图片进行处理并获取数据。

2 结果

2.1鹿胶对Gly诱导的斑马鱼红细胞损伤模型的影响 姬姆萨染色实验表明,经Gly处理后红细胞出现微核、细胞核变宽和空泡现象(图1)。与空白对照组相比,Gly组红细胞核异常率显著增加,细胞核面积显著变小,细胞核长度显著变短(P<0.01)(图2)。与Gly组相比,阿胶组和鹿胶小中大剂量组核异常率显著降低(图2),鹿胶中剂量可显著改善细胞核面积,阿胶组和鹿胶中小剂量组细胞核长度显著改善(P<0.01)(图2)。

A.正常形态,形态椭圆,核位于细胞中央;B.微核;C.细胞核变宽;D.核内空泡。图1 Gly造模后斑马鱼红细胞形态(×400) A.normal form,oval shape,nucleus in the centre of the cell;B.micronucleus;C.widening of the nucleus;D.vacuole in the nucles.Fig.1 Morphology of zebrafish erythrocytes after Gly moulding(×400)

A.斑马鱼红细胞核异常率(n=10);B.斑马鱼红细胞核面积与细胞核长度的统计(n>10 000)。①与空白对照组比较,t=-4.846～17.499,P<0.01;②与Gly组比较,t=-24.007～4.426,P<0.01。图2 鹿胶对Gly诱导的斑马鱼红细胞损伤的影响A.zebrafish erythrocyte nuclear abnormality rate (n=10);B.statistics of zebrafish erythrocyte nuclear area and nucleus length(n>10 000).①compared with blank control group,t=-4.846-17.499,P<0.01;②compared with Gly group,t=-24.007-4.426,P<0.01.Fig.2 Effect of Cervi Colla on Gly-induced erythrocyte damage in

2.2鹿胶对MTX诱导的斑马鱼幼鱼造血功能损伤的作用 与空白对照组相比,MTX组斑马鱼幼鱼造血因子GATA1和SCL表达显著降低,表明造模成功(P<0.05,P<0.01)。与MTX组相比,阿胶组,鹿胶小、中、大剂量组GATA1和SCL的表达升高,表明鹿胶可促进斑马鱼幼鱼造血功能(P<0.05)(图3)。

A.鹿胶对斑马鱼幼鱼GATA1表达的影响;B.鹿胶对斑马鱼幼鱼SCL表达的影响;①与空白对照组比较,t=3.046,P<0.01;②与MTX组比较,t=-9.050～2.404,P<0.05;③与空白对照组比较,t=5.464,P<0.05。图3 鹿胶对MTX诱导的斑马鱼幼鱼造血功能损伤的影响A.effect of Cervi Colla on GATA1 expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on SCL expression in juvenile zebrafish;①compared with blank control group,t=3.046,P<0.01;②compared with MTX group,t=-9.050～2.404,P<0.05;③Compared with blank control group,t=5.464,P<0.05.Fig.3 Effect of Cervi Colla on MTX-induced hematopoietic impairment in juvenile zebrafish

2.3鹿胶对Pred诱导的斑马鱼骨形成抑制的改善作用 钙黄绿素染色结果如图4所示,与空白对照组比较,Pred组斑马鱼幼鱼第一椎骨面积显著降低,表明Pred诱导的斑马鱼幼鱼骨形成抑制模型造模成功(P<0.05)。与Pred组相比,鹿胶小中大剂量组均可促进斑马鱼幼鱼第一椎骨形成,具有显著差异,且第一椎骨面积呈现剂量依赖性,表明鹿胶可改善Pred诱导的斑马鱼幼鱼骨形成抑制,具有健骨功效(P<0.01)。

①与空白对照组比较,t=6.053,P<0.05;②与Pred组比较,t=-7.664～-4.614,P<0.01。图4 鹿胶对Pred诱导的斑马鱼幼鱼骨形成抑制的影响①compared to blank control group,t=6.053,P<0.05;②compared to Pred group,t=-7.664--4.614,P<0.01.Fig.4 Effect of Cervi Colla on Pred-induced inhibition of bone formation in juvenile

PCR结果表明,与空白对照组相比,Pred组ALP和Runx2a表达显著降低。与Pred组比较,鹿胶低中高剂量组均可使ALP、Runx2a表达增加,且中高剂量组促进作用最为显著(P<0.05,P<0.01)(图5 AB)。结果表明鹿胶可促进骨形成中关键基因表达,发挥抗骨质疏松作用。

A.鹿胶对斑马鱼幼鱼ALP表达的影响;B.鹿胶对斑马鱼幼鱼Runx2a表达的影响。①与空白对照组比较,t=6.330～8.728,P<0.05;②与Pred组比较,t=-17.634～-3.803,P<0.05;③与Pred组比较,t=-7.447,P<0.01。图5 鹿胶对斑马鱼幼成骨相关基因表达的影响A.effect of Cervi Colla on ALP expression in juvenile zebrafish;B.effect of Cervi Colla on Runx2a expression in juvenile zebrafish.①compared with blank control group,t=6.330-8.728,P<0.05;②compared with Pred group,t=-17.634--3.803,P<0.05;③compared with the group,t=-7.447,P<0.01.Fig.5 Effect of Cervi Colla on the expression of osteogenesis-related genes in juvenile

2.4鹿胶对DBP诱导的眼部细胞凋亡模型斑马鱼的作用 吖啶橙染色结果如图6所示,与空白对照组相比,DBP组斑马鱼幼鱼眼部凋亡细胞数显著增加,表明DBP诱导的斑马鱼幼鱼眼部凋亡模型造模成功(P<0.01)。与DBP组相比,阿胶组和鹿胶小中大剂量均可明显改善斑马鱼幼鱼眼部凋亡细胞数,且鹿胶组眼部凋亡数呈现剂量依赖性,表明鹿胶具有抗斑马鱼幼鱼眼部凋亡作用(P<0.01)。

①与空白对照组比较,t=-4.655,P<0.01;②与DBP组比较,t=3.986～5.456,P<0.01。图6 鹿胶对DBP诱导的斑马鱼幼鱼眼部凋亡的影响①compared to blank control group,t=-4.655,P<0.01;②compared to DBP group,t=3.986-5.456,P<0.01.Fig.6 Effect of Cervi Colla on DBP-induced ocular apoptosis in juvenile

Western blotting结果如图7所示,与空白对照组相比,DBP组Bcl-2的表达显著降低(P<0.01)。与DBP组相比,给予鹿胶后,Bcl-2的表达呈现剂量依赖性上升,且大剂量组具有显著差异(P<0.01)。PCR结果如图8所示,与空白对照组相比,DBP组线粒体DNA拷贝数显著降低(P<0.01)。给予不同浓度的鹿胶后,线粒体DNA拷贝数增加,中高剂量组促进作用具有显著差异(P<0.01)。表明鹿胶可通过增加线粒体DNA拷贝数改善斑马鱼幼鱼的细胞凋亡。

①与空白对照组比较,t=9.364,P<0.01;②与DBP组比较,t=-19.582～-3.864,P<0.01。图7 鹿胶促进抗凋亡因子Bcl-2的表达①compared to blank control group,t=9.364,P<0.01;②compared to DBP group,t=-19.582--3.864,P<0.01.Fig.7 Cervi Colla promoted the expression of the anti-apoptotic factor Bcl-2

①与空白对照组比较,t=23.059,P<0.01;②与DBP组比较,t=-13.506～-5.922,P<0.01。图8 鹿胶对DBP诱导的斑马鱼幼鱼的线粒体拷贝数的影响①compared to blank control group,t=23.059,P<0.01;②compared to DBP group,t=-13.506--5.922,P<0.01.Fig.7 Effect of Cervi Colla on DBP-induced mitochondrial copy number in juvenile

3 讨论

胶类中药是以动物的皮、角等原料制成的固体胶,味甘、性平,具有滋阴、补血、止血、润燥等功效,临床用于血虚、阴虚和出血等证,在古方中大多与其他药物配伍使用,多为补虚的要药[8]。研究表明,胶类中药对血液系统、骨骼系统、心血管系统疾病有较好的补益作用。血虚证是血液亏虚、脏腑百脉失养而表现全身虚弱的证候,是临床中的常见病症,其发生多由生血乏源、失血过多等引起。阿胶等胶类中药可通过促进红细胞生成的关键因子生成等方面促进造血功能,改善血虚症状,发挥补益作用。本研究采用Gly诱导斑马鱼成鱼红细胞损伤模型,探究鹿胶对Gly造成的红细胞损伤的缓解作用。研究表明,Gly会诱发斑马鱼外周血红细胞的遗传损伤[9]。本研究实验结果表明,鹿胶可改善Gly造成的斑马鱼红细胞形态变化,其改善血虚作用可能与减少红细胞损伤有关。MTX作为一种抗肿瘤药物,可造成斑马鱼红细胞造血功能损伤。斑马鱼与人类造血过程近似,其造血过程分为原始造血和定向造血[10]。SCL基因在原始造血中调控造血功能[11],GATA-1是调控红细胞发育的主要因子[12]。本研究实验结果表明,鹿胶可提高造血因子SCL、GATA-1的表达,通过调节造血中关键基因表达改善斑马鱼造血功能。血虚的形成可能与多种因素相关,鹿胶改善红细胞形态和促进造血因子基因表达作用可能是其补血功效的现代药理学基础,其作用的详细机制仍需进一步研究。

骨质疏松症在中医中归为“骨痿、骨痹”,其病机以肾虚为主、脾虚为辅[13]。其治法以补肾健脾为代表。

本研究采用Pred诱导斑马鱼幼鱼骨形成抑制模型,探究鹿胶抗骨质疏松的补益作用。糖皮质激素长期使用可引起骨质疏松的发生,ALP和转录因子Runx2在骨形成中发挥重要作用。实验结果表明,鹿胶可显著改善Pred导致的斑马鱼骨形成抑制,促进成骨相关基因ALP、Runx2a的表达。鹿胶可通过促进骨形成中关键因子的基因表达,发挥强筋健骨功效。

衰老是细胞和机体水平发生的功能退化的过程[14]。《素问·上古天真论》中认为衰老与肾虚密切相关。肾为先天之本,肾精气亏虚容易导致心、肝、脾、肺虚。本研究采用DBP诱导斑马鱼幼鱼眼部凋亡模型,探究鹿胶抗细胞凋亡的补益作用。DBP可诱导斑马鱼眼部细胞凋亡[15-16]。Bcl-2是抗凋亡蛋白,可抑制发育过程中的细胞凋亡[17]。本研究表明,鹿胶可显著降低DBP诱导的斑马鱼幼鱼眼部凋亡细胞数,促进抗凋亡蛋白Bcl-2和线粒体DNA的表达。本研究提示,鹿胶可能通过促进抗凋亡蛋白Bcl-2表达发挥抗衰老作用。

本研究利用多种斑马鱼模型探究鹿胶补益作用,结果表明其具有较好的补血、健骨、抗衰老等补益作用,为其广泛应用和深入研究提供依据。