李宾，吝欢欢，韩飞飞，田美玲，段爱红，柯小宁

卵巢癌是妇科三大常见恶性肿瘤之一，死亡率居妇科恶性肿瘤之首[1]。由于缺乏典型的早期症状及有效的筛查手段，约70%的患者在诊断时已为晚期，5 年生存率仅约30%[2]。目前公认的一线治疗方案是手术和含铂化疗，但长期效果并不满意，超过70%的患者在2 年内复发[2]。近年来，维持治疗已成为延长治疗反应时间和疾病复发间期的重要策略[3]。多项临床试验证实多腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂[poly(ADP-ribose)polymerase inhibitor，PARPi]可使卵巢癌患者获益[4-5]，为卵巢癌的治疗开启了新篇章。尽管已证实PARPi 可以延长卵巢癌患者的无进展生存期，但癌细胞不可避免地会产生耐药性，这成为PARPi长期使用的障碍。因此，迫切需要对PARPi 的作用机制和耐药机制进行研究，以期克服PARPi 的耐药性并提高其敏感性。现就PARPi 的作用机制、潜在耐药机制及提高PARPi 敏感性的策略进行综述。

1 PARP 概述

PARP 是一类催化靶蛋白或其自身ADP-核糖基化的细胞核酶，在DNA 单链断裂（single-strand breakage，SSB）的碱基切除修复（base excision repair，BER）中发挥至关重要的作用。目前已知的PARP 家族由18 个成员组成，其中PARP1 是最重要的酶，占细胞内PARP 总活性的85%～90%。PARP1 参与DNA 修复、维持基因组完整性和DNA 复制叉的稳定以及染色质重塑等，是该家族中研究最多的成员[6]。当感应到SSB 信号后，PARP1 的锌指结构域迅速识别并结合在损伤位点，构象改变并激活PARP1 催化活性，催化β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-nicotinamide adenine dinucleotide，β-NAD+）分解为ADP-核糖和烟酰胺，然后以分解产生的ADP-核糖为底物，使核受体蛋白（包括PARP1 自身、DNA 修复因子、组蛋白以及各种转录因子等）发生多ADP-核糖基化修饰[Poly(ADP-ribosyl)ation，PARylation]，然后进一步募集下游DNA 损伤修复相关蛋白[如XRCC1、DNA连接酶3 和DNA 聚合酶θ（DNA polymerase θ，Polθ）等]迅速迁移至损伤部位，重塑受损DNA 的染色质结构，从而有效修复SSB[6]。由于负电荷大量蓄积，导致PARP1 从DNA 上解离下来，解离下来的PARPADP 聚合物在多ADP-核糖水解酶 [poly (ADPribose)glycohydrolase，PARG]作用下被裂解。裂解后的ADP-核糖可重新用于合成β-NAD+，而重新形成单体的PARP1 可被再次激活，循环作用于DNA 损伤位点，完成DNA 损伤修复，这一过程即为PARP1催化循环[6]。

2 PARPi 的作用机制

2.1 酶促抑制PARP1 的酶活性可被PARPi 靶向抑制，使之不能通过PARylation 进一步募集DNA 损伤修复相关蛋白发挥作用[6]。PARPi 干扰SSB 的修复，导致未修复的SSB 积累，持久的SSB 未能及时修复纠正使DNA 复制叉停滞或减速，转化为高度细胞毒性的DNA 双链断裂（double-strand breakage，DSB）。正常情况下，同源重组修复（homologous recombination repair，HRR）可高保真修复DSB，使细胞存活，而乳腺癌相关基因（breast cancer-related gene，BRCA）缺陷或同源重组缺陷（homologous recombination deficiency，HRD）的肿瘤细胞则不能通过HRR 进行修复，需启动非同源末端连接（nonhomologous end joining，NHEJ）进行修复，引起基因组不稳定，从而杀伤肿瘤细胞。以上即为PARPi 与BRCA 缺陷（或HRD）联合的合成致死的基本原理，推动了PARPi 在临床治疗中的应用，并且在多项临床试验中使卵巢癌患者获益，其已经应用于卵巢癌的一线和二线维持治疗。目前，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）获批上市的PARPi 有奥拉帕利（Olaparib，2014）、鲁卡帕利（Rucaparib，2016）、尼拉帕利（Niraparib，2017）和他拉唑帕利（Talazoparib，2018）。

2.2 PARP“捕获”（PARP trapping）随着对PARPi 的深入研究，发现其作用机制不局限于通过竞争性结合PARP 的催化结构域活性位点，阻断和抑制PARP 酶活性。越来越多的研究认为PARPi 可干扰PARP 发生PARylation，使其不能从DNA 上解离，而将PARP“捕获”于DNA 损伤位点，稳定的PARP-DNA 复合物可抑制SSB 修复，并使停滞的DNA复制叉降解为DSB，从而比酶促抑制能更有效地杀伤癌细胞[7]。相关研究表明，PARPi 引起的PARP“捕获”造成的细胞毒性高于单纯的PARP 缺失或功能抑制[8]。然而，虽然已显示出相同的抑制PARP 催化活性的能力，但是目前也并非所有临床阶段的PARPi 都具有相同的PARP“捕获”活性。“捕获”PARP 的能力与每种药物杀伤癌细胞的能力密切相关，目前临床上的PARPi 可根据其“捕获”PARP 的能力和细胞毒性效力进行排名（从最强到最弱）：他拉唑帕利＞＞尼拉帕利＞奥拉帕利=鲁卡帕利＞＞维利帕尼（Veliparib，未上市）[8-9]。

3 PARPi 的耐药机制

尽管PARPi 治疗已取得一定效果，但随着临床实践中越来越多的应用不可避免地引发了PARPi的耐药性问题，以及随之而来的疾病复发和患者预后不良。较多研究探索了PARPi 获得性耐药的机制，包括HRR 恢复、DNA 复制叉保护、PARP“捕获”减少及药物外排增加等。然而目前其具体机制仍未完全阐明，且同一个体可能存在多种机制并随着时间的推移而变化，PARPi 在临床应用中仍具有挑战。

3.1 HRR 恢复PARPi 最常见的获得性耐药机制是HRD 肿瘤中HRR 的恢复[10]。HRR 的恢复可通过HRR 相关蛋白表达的恢复或对HRR 途径抑制作用的减弱，从而减少基因组的不稳定性和复制压力。其中，体细胞回复突变是恢复HRR 相关蛋白表达最典型的方式。体细胞回复突变即体细胞移码突变或无义突变的肿瘤中恢复HRR 相关基因的开放阅读框（open reading frame，ORF），导致功能性蛋白质的重新表达，从而部分恢复HRR[11]。除BRCA1/2 基因外，体细胞回复突变还发生在多个其他HRR 相关基因中，如RAD51C、RAD51D 和PALB2[12]。另外，BRCA1启动子区去甲基化可导致因甲基化表观遗传学沉默的BRCA1 蛋白的重新表达[11]。此外，BRCA1 外显子11 中的移码突变可能产生BRCA1 蛋白亚型（BRCA1-δ11q），仍然具有部分残留活性，可导致PARPi 的部分耐药性[13]。

恢复HRR 的另一种机制是BRCA 缺陷癌细胞中DNA 损伤反应的重新选择，即通过下调NHEJ，减少对HRR 途径的抑制[11，14]。HRR 和NHEJ 竞争性修复DSB，正常情况下BRCA1 蛋白通过抑制p53 结合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）启动HRR，BRCA1 蛋白的缺失会阻止53BP1 从DNA 末端释放并招募相关因子（RIF1、REV7 和shieldin），通过保护DNA 末端启动NHEJ。53BP1 及相关因子的功能丧失将导致DNA 末端切除，使RAD51 在缺乏BRCA1蛋白的情况下被募集并恢复HRR，从而使癌细胞对PARPi 产生耐药性。

3.2 DNA 复制叉保护DNA 复制叉的稳定性是诱导PARPi 耐药的机制之一。在DNA 复制过程中，Pax 转录激活结构域互作蛋白（Pax transactivation domain-interacting protein，PTIP）和Zeste 基因增强子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）负责募集核酸酶MRE11 和MUS81，使得PARP1 和BRCA1/2 蛋白保护停滞复制叉处的新生DNA 不被核酸酶降解[14-15]。然而，在BRCA 缺陷的癌细胞中，EZH2 和PTIP 活性在复制叉处受到限制，从而减少核酸酶的募集并导致复制叉保护。此外，已证明染色质重塑因子SMARCAL1、ZRANB3 和HLTF 是MRE11依赖性复制叉降解所必需的，BRCA 缺陷的癌细胞中这些因子的缺失可保护复制叉免受降解[15]。可见，PARPi 可使未受保护的复制叉崩解，复制叉保护则导致PARPi 耐药。

3.3 PARP“捕获”减少PARP1 突变和PARG 的缺失使PARP1 的“捕获”减少，从而引起对PARPi 的耐药[11,16]。研究发现一种常见于PARPi 耐药患者肿瘤样本中的PARP1 突变（R591C），这与PARP1 在DNA上的“捕获”减少有关，从而导致PARPi 耐药[17]。PARG 可逆转PARylation，防止多ADP-核糖积累，因此，PARG 与PARPi 协同发挥作用。体外实验发现，在PARPi 处理的BRCA2 缺陷的乳腺癌细胞中，阻断细胞PARG 的表达引起多ADP-核糖积累，从而通过增加PARP1 依赖性DNA 损伤修复来减少PARP1 在DNA 上的“捕获”，导致PARPi 耐药；另外，在浆液性卵巢癌和三阴性乳腺癌组织中均发现了PARG 阴性表达[18]。推测卵巢癌可能也通过这种机制导致耐药，有助于患者PARPi 耐药性的预测。

3.4 药物外排增加目前普遍认为编码药物外排泵P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的ABCB1 基因的过度表达是不同类别药物化疗耐药的常见机制[19]。肿瘤细胞通过增加药物外排泵的数量促进药物外排，降低细胞内药物浓度，从而减弱药物的治疗作用，产生耐药性。已在PARPi 耐药的卵巢癌细胞系中观察到P-gp 的过度表达，并且PARPi 与P-gp抑制剂Tariquidar 的共同治疗可恢复肿瘤细胞对PARPi 的敏感性[16,20]。提示P-gp 可能是增加PARPi敏感性的一个重要靶点。

3.5 其他①信号通路失调：已报道细胞间质表皮转化因子（cellular mesenchymal to epithelial transition factor，c-MET）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）/ATM 和Rad3 相关蛋白激酶（ATM and Rad3 related kinase，ATR）等信号通路的异常调节与PARPi 耐药有关[11，14-15]。受体酪氨酸激酶c-MET 可直接磷酸化PARP1，激活PARP1 酶活性，降低与PARPi 的结合亲和力，从而诱导PARPi 耐药性[21]。另外，PARPi 可激活PI3K/Akt 通路，进而激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），导致BRCA1、RAD50、RAD51 和FANC2 的表达增加，诱导细胞凋亡抵抗和线粒体保护，从而促进肿瘤细胞生长和增殖[22]。ATM 和ATR是DNA 损伤反应途径中的重要因子，主要负责募集组蛋白H2A 和DNA 修复复合物，ATM/ATR 通路的激活可通过恢复HRR 导致PARPi 耐药[23]。②细胞周期控制的改变：细胞周期调节因子如细胞周期蛋白依赖性激酶12（cyclin-dependent kinases 12，CDK12）可以调节DNA 损伤修复基因的转录；WEE1 作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以通过抑制CDK1 和CDK2 的活性将细胞周期阻滞在G2/M 期，为DNA修复提供时间。研究发现，CDK12 和WEE1 的过度表达可通过恢复HRR，促进PARPi 耐药性[16,24]。③微小RNA（microRNA，miRNA）：多项研究发现miRNA与PARPi 耐药性有关，如miR-622 通过直接抑制NHEJ 途径中Ku70/80 异二聚体的表达，促进HRR修复，诱导PARPi 耐药[25]。此外，拮抗miR-182 可使BRCA1 蛋白表达升高，通过促进HRR 诱导PARPi耐药[26]。

4 提高PARPi 敏感性的策略

以上PARPi 的作用机制和耐药机制为克服PARPi 耐药和提高敏感性提供了理论基础。通过针对特定耐药机制的抑制，药物的联合治疗策略有可能预防和对抗PARPi 的耐药性，从而提高PARPi 的敏感性和抗肿瘤作用。目前正在研究的主要的联合治疗策略如下。①联合抗血管生成药物：PARPi 和抗血管生成药物可能是上皮性卵巢癌中评估最多的组合[16,19]，主要的抗血管生成药物有贝伐珠单抗和西地尼布。抗血管生成药物可引起细胞缺氧，诱导HRR信号通路下调，导致HRD。对于PARPi 维持治疗后肿瘤进展的卵巢癌患者，抗血管生成药物与PARPi联合使用可能会带来一些临床益处[27]。尽管该组合的潜在机制仍未完全清晰，但现有研究显示PARPi和抗血管生成药物之间具有协同作用。②联合细胞周期检查点蛋白抑制剂：主要包括ATR、CHK1 和WEE1 抑制剂[11]。PARPi 与细胞周期检查点蛋白抑制剂相结合可以最大限度地增加细胞周期G1 期和S期的损伤累积，并通过最小化修复时间来抑制G2期的修复，从而增加DNA 损伤并导致细胞死亡，二者具有协同作用，可应用于HRR 恢复和DNA 复制叉保护引起的耐药。③联合PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂：PI3K/Akt/mTOR 通路在高级别浆液性卵巢癌的发生、发展中发挥重要作用。PARPi 和PI3K/Akt/mTOR 通路抑制剂联合应用可诱导HRD 为中心的多种机制，二者具有协同作用。如PI3K 抑制剂可下调BRCA1/2 表达并诱导HRD[16]；mTOR 抑制剂可抑制DSB 修复蛋白SUV39H1，同时抑制HRR 相关基因表达[28]。④联合Ras/Raf/丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路抑制剂：Ras/Raf/MEK/ERK 通路激活后参与BRCA1 的转录调控。MEK 抑制剂的基本原理为诱导HRD、降低DNA 损伤检查点活性和促进细胞凋亡。PARPi 和Ras/Raf/MEK/ERK 通路抑制剂协同作用，通过增加DNA 损伤和细胞凋亡提高卵巢癌细胞对PARPi 的敏感性[19]。⑤联合表观遗传修饰剂：表观遗传学修饰剂主要有溴结构域和超末端结构域（bromodomain and extraterminal domain，BET）抑制剂和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制剂。细胞系和异种移植卵巢癌模型的临床前数据均表明，抑制BET 和HDAC 可以通过增强PARP 相关的DNA 损伤，减少BRCA1 蛋白表达，以及通过破坏复制叉进程增加基因组不稳定性，诱导HRD，从而增强PARPi 的活性[29]。然而，这些药物的临床前景因血液学毒性受到限制。⑥抑制药物外排：由于药物外排泵P-gp 在PARPi 耐药卵巢癌细胞中过度表达，PARPi 和外排泵抑制剂Tariquidar 的联合治疗可恢复卵巢癌细胞对PARPi 的敏感性[20]。另外，研发高选择性PARPi 可以避免这种耐药机制并克服耐药性。⑦联合免疫治疗：该联合治疗策略的基本原理基于两个假设，其一，PARPi 治疗HRD 的卵巢癌具有更高的肿瘤突变负荷，导致肿瘤新抗原负荷升高，刺激抗肿瘤免疫反应增强，即PARPi 通过提高突变负荷来增加患者对免疫治疗的敏感性；其二，PARPi 治疗可通过激活干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes，STING）通路激活先天免疫反应，并可上调程序性死亡受体配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达，PARPi 联合免疫治疗可增强抗肿瘤作用[19]。Ⅱ期临床试验表明，PARPi 和抗PD-L1 抗体度伐利尤单抗（Durvalumab）联合使用对胚系BRCA1/2 突变的乳腺癌和卵巢癌均表现出良好的反应[16]。此外，目前该联合治疗策略对新诊断和复发（铂敏感或耐药）卵巢癌患者的疗效的相关临床试验仍在进行中。⑧联合Polθ 抑制剂：HRD 肿瘤细胞的修复依赖于替代NHEJ（aNHEJ），包括微同源介导的末端连接（MMEJ）。Polθ 在卵巢癌中表达上调并通过MMEJ 修复DSB[11]。新生霉素可抑制Polθ 的ATP 酶活性，引起DNA 损伤和细胞死亡，从而增强PARPi 活性。有研究发现，Polθ 的小分子抑制剂ART558 可抑制MMEJ 修复过程，在BRCA1/2 突变细胞（包括卵巢癌和乳腺癌细胞）中引起DNA 损伤和合成致死效应，并增强PARPi的作用[30]。因此，Polθ 抑制可能是卵巢癌药物治疗的潜在策略，可与PARPi 联合或单独应用。

5 结语与展望

目前越来越多的卵巢癌患者可以通过PARPi维持治疗获益，然而，耐药性问题成为其临床应用的障碍。PARPi 耐药性是由多种机制引起的，且在同一个体中可能存在多种耐药机制。因此，PARPi 耐药性在临床治疗中可能与临床前研究不同，需要更多的临床样本和研究来进一步确定更全面的PARPi 耐药机制。药物的联合治疗策略可能有助于改善PARPi 的耐药性，提高其敏感性，但仍需要更多研究证实。另外，哪种联合治疗策略可使患者获益最大、联合用药是否会产生更多的毒副作用、患者能否承受多种药物的经济压力，这些都是临床关注的热点问题，有待更多研究明确。