刘淑甜 李 燕 唐炜轩 李艳玲

(北京农学院动物科学技术学院,北京 102206)

现代化奶牛生产中,集约化和规模化成为主流养殖模式,其中早期断奶已作为奶牛业中的一项关键技术被广泛应用。然而,早期断奶使犊牛产生应激,引起炎症反应,造成机体免疫功能下降。断奶时犊牛营养的来源由液态母乳转变为固态植物性饲料,饲粮转换以及母子分离产生的应激会影响犊牛早期生长发育。犊牛由于断奶而发生腹泻是断奶应激最常见的反应[1]。在断奶期间,犊牛的食欲和营养物质采食量通常会受到抑制,进而影响生长性能[2]。此外,犊牛突然断奶会导致血浆皮质醇、去甲肾上腺素及急性相蛋白含量升高,同时伴随着中性粒细胞和淋巴细胞数量的增加以及白细胞抗氧化酶活性的降低,表明断奶犊牛出现氧化应激反应[1,3]。断奶应激引起的犊牛免疫功能抑制会增加呼吸道疾病的发病率和死亡率[2]。近年来,许多研究表明饲粮中添加益生菌和植物提取物等可以缓解犊牛断奶应激。本文将重点从断奶应激对犊牛机体健康的影响、作用机理及其营养调控进行综述,旨在为深入研究犊牛断奶应激提供理论依据和调控思路。

1 断奶应激的起因及其对犊牛的影响

1.1 断奶应激的起因

断奶期是犊牛生长发育的关键阶段,在断奶过程中,饲料形态和成分的改变、亲子纽带的破坏、社群关系以及环境的变化均会引起犊牛的应激,对其生长发育和健康产生不利影响,引发体重下降、发病率上升和死亡率增加等问题[4]。断奶应激主要包括营养应激和心理应激2个方面[5]。营养应激主要是饲料形态和营养成分转变引起的,当固态植物性饲料替代牛乳成为主要的能量来源,犊牛的消化系统和生理尚未发育完全,无法及时适应这种转变,导致营养物质采食量下降,从而影响犊牛的消化和代谢等生理过程,并对免疫系统的建立以及维持免疫调控和免疫反应之间的平衡产生影响[6]。营养物质采食量的降低会导致犊牛免疫功能障碍,甚至产生慢性应激和免疫系统抑制,影响机体健康[7]。心理应激主要是犊牛在断奶应激的影响下,下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA轴)被激活并发挥调节作用。HPA轴激活使身体处于充分动员的状态,提高机体代谢率,增加机体消耗;此外,由于幼龄动物的适应性免疫系统发育不完全,会依赖于HPA轴调节免疫系统,这种应激反应可能会破坏动物的免疫系统,并影响一系列的生理代谢活动[8]。因此,断奶应激可以表现为各种相互关联的生理、代谢、内分泌和免疫防御过程,从而损伤动物机体健康。

1.2 断奶应激对犊牛胃肠道和免疫功能的影响及作用机理

1.2.1 对犊牛胃肠道和免疫功能的影响

断奶应激会导致犊牛免疫系统抑制,诱发犊牛胃肠道功能障碍并引起腹泻。腹泻是导致断奶犊牛生长迟缓和死亡的主要原因,极大影响犊牛福利,并造成严重的经济损失[9]。断奶应激会破坏胃肠道屏障功能,增加犊牛肠道通透性,导致来自肠腔的细菌或细菌产物进入黏膜组织诱发宿主免疫反应。断奶期间,由于饲粮从母乳向固体饲料过渡,犊牛胃肠道形态和代谢发生变化,突然摄入富含淀粉的饲粮可能会增加瘤胃挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)含量,降低瘤胃pH,引发瘤胃酸中毒,破坏瘤胃上皮完整性,并增加脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)等抗原的含量[10]。Wickramasinghe等[11]用血液中的乳果糖-甘露醇比率评估肠上皮的细胞旁通透性,发现断奶应激增加犊牛细胞旁通透性,破坏肠道屏障;血清触珠蛋白和血浆LPS结合蛋白含量升高,诱发机体炎症反应。Wood等[12]基于菊粉和甘露醇的易位,发现断奶时犊牛瘤胃、十二指肠和空肠可能是渗透性最强的区域,表明断奶损害了整个胃肠道屏障功能。此外,断奶应激对胃肠道微生物群也会造成影响。胃肠道微生物群的逐渐发育始于出生时,最显著的变化发生在断奶期,断奶会影响犊牛胃肠道微生物群的多样性。研究表明,断奶期间犊牛的瘤胃微生物群多样化和均匀度降低,而粪便微生物群在断奶后具有更大的丰富度和均匀度,这可能是由于断奶后犊牛固体饲料摄入量增加,传递到后肠道的底物量也随之增加,更高的底物可利用性提高了微生物群多样性[13]。

此外,断奶时犊牛主动免疫还没发育完全,且不能再从母乳中获得被动免疫,当受到细菌侵袭后会导致犊牛免疫系统抑制,进而诱发机体炎症反应并导致腹泻。研究发现,断奶后犊牛血清免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)含量较断奶前下降[14],表明断奶应激会降低犊牛体内抗体水平,抑制细胞免疫水平,从而降低犊牛被动免疫。一些研究报道了断奶应激对犊牛免疫功能的影响,如断奶应激增加中性粒细胞数量,并减少淋巴细胞数量,导致较高的中性细胞与淋巴细胞的比值(N∶L)。Lynch等[15]研究发现,与断奶前基线相比,断奶后第2天中性粒细胞数量和N∶L增加,淋巴细胞数量在第2～7天下降。此外,过度活跃的中性粒细胞暴露于溶血性曼氏杆菌后,可能会对肺脏组织造成损害,引起犊牛呼吸道疾病[16]。断奶应激可诱导急性期蛋白产生反应,导致结合珠蛋白和血清淀粉样蛋白A含量增加[17-18],并对免疫细胞产生抑制。同时,断奶应激可以影响多种细胞因子的分泌,引起相关基因mRNA表达量显著上调,如O’Loughlin等[19]研究发现,断奶应激导致白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达量增加。此外,断奶应激会引起糖皮质激素受体a(GRa)、促凋亡基因Fas和革兰氏阴性模式识别受体Toll样受体4(TLR4)的mRNA表达量增加,引发全身的炎症反应。

1.2.2 影响犊牛胃肠道与免疫功能的作用机理

犊牛在断奶期间会受到多种压力因素的影响,导致胃肠道损伤,增加疾病易感性,诱导免疫功能障碍,危害犊牛机体健康并影响其生长性能。断奶应激会影响胃肠道微生物结构,导致菌群失调,进而影响犊牛胃肠道和免疫功能。据报道,肠道微生物对于肠道上皮通透性的改变以及肠黏膜上皮和黏膜免疫系统的发育和分化至关重要,进而对宿主代谢和肠道健康产生影响[20]。幼龄动物肠道发育过程中宿主与微生物存在相互作用,有研究发现,宿主使用模式识别受体,如Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)能够区分病原体和非致病性共生微生物,并维持肠道内稳态[21]。病原体入侵肠道组织激活TLR信号通常会刺激机体产生炎症反应,而TLR信号的共生微生物激活会产生免疫反应,从而保护肠上皮细胞免受损伤[21]。Malmuthuge等[22]对犊牛空肠、回肠、盲肠和结肠中TLR(TLR1～TLR10)的表达进行比较发现,TLR2和TLR6的表达在断奶后显著上调,这可能是断奶后犊牛肠道通透性增加的结果,导致细菌或细菌代谢物突破黏膜屏障,刺激宿主模式识别受体的表达。此外,研究表明肠黏膜TLR的表达与黏膜附着细菌呈负相关,表明肠道微生物与肠道黏膜免疫反应之间存在联系,且与年龄相关[22]。Liang等[23]研究发现,与微生物数量相关的微小RNAs(microRNAs,miRNAs)参与淋巴组织发育(miR-196)、树突状细胞成熟(miR-29)和免疫细胞发育(miR-15/16),从而揭示了早期胃肠道miRNAs表达与微生物数量之间的相关性,进一步表明宿主-微生物相互作用可调节肠道发育。此外,断奶会影响功能性基因和蛋白质的表达,进而影响犊牛胃肠道功能。Malmuthuge等[22]研究发现,断奶犊牛肠上皮细胞中TLR2、TLR6和肽聚糖识别蛋白1表达上调,而紧密连接蛋白封闭蛋白4(Claudin4)和闭合蛋白(Occludin)表达下调,表明断奶应激会增加肠道通透性。断奶可以影响犊牛胃肠道发育及肠道免疫功能,其机制主要是通过改变胃肠道微生物区系从而对肠黏膜屏障产生影响,或者通过改变功能性基因的表达影响犊牛的胃肠道系统,而是否存在其他的断奶调控机制还需要进一步研究论证。

此外,适应性免疫系统尚未发育完全的断奶犊牛依赖HPA轴作为免疫的主要调节器。断奶应激会激活HPA轴从下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素,并与垂体上的受体结合,从而刺激促肾上腺皮质激素的释放,调节皮质醇和其他激素进入血液[24-25],改变细胞因子的分泌,激活急性期蛋白,并对免疫细胞产生抑制[25]。糖皮质激素可抑制白细胞、单核细胞以及巨噬细胞向炎症区域聚集,并抑制这些细胞产生和释放细胞因子[26]。断奶应激引起的糖皮质激素含量升高还会引起L-选择素表达下调,导致中性粒细胞无法附着到组织发挥作用[27]。在应激作用下,促肾上腺皮质激素释放激素可以抑制淋巴细胞的增殖,并促进已招募到血液中的淋巴细胞迁移到淋巴组织中,导致血液淋巴细胞数量减少[28]。断奶应激通过糖皮质激素受体干扰犊牛细胞转录因子核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)活化,从而降低其后续启动子的激活和相关炎症细胞因子的基因表达[29]。此外,断奶应激通过糖皮质激素阻止了激活子蛋白-1的激活及与DNA的结合,进一步加强了对NF-κB生物活性的抑制作用,使犊牛产生免疫抑制。糖皮质激素分泌量增加,激活HPA轴产生细胞因子,从而抑制机体的免疫功能,引起免疫系统异常,导致机体在病毒感染时抵抗力下降,容易诱发细菌感染[30]。此外,炎性细胞因子可以反馈调节HPA轴的分泌水平和/或稳定性。如断奶应激可通过增加白细胞介素-1(IL-1)受体的表达,导致垂体前叶对促炎细胞因子的敏感性增加,刺激垂体产生促肾上腺皮质激素,随后产生糖皮质激素[31]。因此,断奶应激导致机体激素水平的改变会引起细胞因子的分泌,从而造成自身免疫调节发生异常,引起机体炎症反应,从而增加犊牛患病率。

1.3 断奶应激对犊牛生长性能的影响及作用机理

1.3.1 对犊牛生长性能的影响

断奶时饲料形态发生变化会改变犊牛的消化系统,影响犊牛营养物质摄入量,降低犊牛体重和日增重,进而影响犊牛的生长性能[32]。Sweeney等[33]报道,犊牛在42 d早期断奶时固体饲料摄入量减少。有研究发现,早期断奶的犊牛固体饲料摄入量会降低,而晚期断奶的犊牛固体饲料摄入量会增加[34]。与晚期断奶相比,早期断奶犊牛的体重和日增重都较低,原因可能是固体饲料的摄入促进瘤胃的发育和活动,增加了能量需求,从而增加维持代谢率[34]。Enríquez等[35]研究报道,采用突然断奶的方法通常会对犊牛造成更大的生理压力,导致采食量和日增重减少。Steele等[36]研究发现,与逐渐断奶相比,突然断奶的犊牛在断奶后生长速度下降更快。由此可见,断奶应激对犊牛生长性能的影响与断奶方式和断奶时间有关,早期断奶和突然断奶对犊牛采食量、日增重以及体重的影响更大。

1.3.2 调控犊牛生长性能的作用机理

断奶应激影响营养物质的消化代谢导致犊牛处于分解代谢状态,直接影响犊牛的生长性能。断奶时固体饲料尤其是高度发酵的碳水化合物的摄入刺激瘤胃发酵和VFA的产生,从而促进瘤胃发育和瘤胃微生物的活性[37]。断奶犊牛从肠道葡萄糖代谢到瘤胃VFA代谢的生理转变,导致犊牛的血液葡萄糖含量降低,然而,早期断奶犊牛不能通过肝脏糖异生来弥补饮食中葡萄糖的缺乏。同时,断奶引起的犊牛血液皮质醇含量升高也可能会潜在影响葡萄糖代谢[38]。皮质醇可以通过干扰胰岛素分泌或机体对胰岛素的敏感性增强糖异生,并抑制肝外葡萄糖利用[39]。因此,脂肪和蛋白质很可能加速分解以获得能量,并产生糖异生的前体。在应激状态下,机体的分解代谢高于合成代谢,呈负氮平衡,断奶期蛋白质分解速率增加可能会导致体内尿肌酐和尿素含量增加。断奶时犊牛营养物质采食量降低导致发酵底物供应较少,瘤胃微生物蛋白质合成所需的能量相对不足,尿素会通过循环进入瘤胃补偿较低的蛋白质供应,从而导致其含量降低。突然断奶会引起机体的脂肪动员,产生非酯化脂肪酸和多不饱和脂肪酸参与β氧化。此外,断奶应激引起的急性期蛋白含量的增加可能导致碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的紊乱[40],从而影响动物的生长。综上所述,断奶应激可以通过一些激素改变或/和刺激瘤胃微生物活性而影响犊牛营养物质的消化代谢水平,从而影响其生长性能。

2 缓解犊牛断奶应激的营养调控措施

2.1 补充益生菌

益生菌是通过定殖在机体内改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。益生菌可以改善肠道菌群,并通过加速肠道免疫系统成熟来刺激机体免疫系统发育,提高机体免疫力及生长性能。研究发现,补充植物乳杆菌[1.7×1010CFU/(h·d)]可以改善犊牛的生长性能和营养物质消化率,并降低血液皮质醇的含量,缓解犊牛断奶应激[41]。Zhou等[42]研究发现,在代乳粉中补充地衣芽孢杆菌(0.15 g/kg)可以增加胰岛素样生长因子-1的含量,提高断奶牦犊牛的平均日增重。另有研究发现,在饲粮中添加活性干酵母(5 g/d)可以改善断奶犊牛瘤胃发酵、抗氧化能力和免疫功能,从而促进断奶犊牛的生长性能[43]。此外,补充乳酸菌(10 g/d)可以增加犊牛肠道菌群和共生微生物的多样性和丰富度,显著改善肠道代谢物的含量和代谢模式[44]。益生菌可能通过防止肠道病原体定植、提高消化能力和改善黏膜免疫等不同机制影响肠道健康[45]。研究显示,双歧杆菌通过TLR2和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)调节细胞间紧密连接蛋白,改善肠上皮屏障[46]。酿酒酵母菌可以调节肠道上皮细胞中的免疫基因表达,抑制产肠毒素大肠杆菌介导的细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)和p38 MAPK信号通路激活[47]。嗜热链球菌ST285可以通过调节细胞因子、趋化因子和细胞标志物的基因表达发挥抗炎和免疫调节作用,维持胃肠道免疫稳态[48]。因此,益生菌可通过抑制肠道病原菌,改善肠道屏障,缓解犊牛断奶应激,提高断奶犊牛的生长性能。

2.2 补充植物提取物

近年来,人们发现植物提取物具有抗菌、抗炎、抗氧化及改善动物生长性能等多种功能。植物提取物可用作一种新型饲料添加剂,提高机体免疫力,并改善动物肠道微生物群,对动物健康生长产生积极影响。按照提取物的成分不同,分为生物碱类、黄酮类、多糖类、植物精油类和有机酸类化合物。研究发现,补充800 mg/d植物提取物(丁香酚、肉桂醛和辣椒)可以提高断奶犊牛的饲料效率,并增加机体对牛呼吸道合胞病毒疫苗的血清抗体反应,提高犊牛免疫力[49]。Kong等[50]研究发现,黄酮类化合物可以通过破坏病原体细胞膜的完整性和代谢,抑制病原体的生长,从而降低犊牛腹泻,改善断奶犊牛的日增重和饲料效率,并缓解断奶应激。补充3 g/kg植物精油(香芹酚、百里酚和柠檬烯)能够调节瘤胃发酵参数和血液代谢产物,提高断奶后犊牛的生长性能[51]。另有研究显示,在犊牛饲粮中添加300 mg/kg的植物精油(迷迭香、多花札子和薄荷)可以缩短断奶时间,增加断奶期犊牛体重,提高生长性能,缓解断奶应激[52]。然而,植物精油的效果也因其来源、化学成分、添加剂量及精油活性化合物之间的协同效应不同而不同[53]。例如,补充肉桂醛和大蒜油(300 mg/d)对犊牛断奶前后的生长性能没有显著影响[54]。综上所述,补充植物提取物可以改善犊牛生长性能,提高免疫力,可为缓解犊牛断奶应激提供新思路。

2.3 其他

谷氨酰胺是小肠上皮中内源性物质(氨基酸、核酸等)合成的能量来源和前体,是哺乳动物中最丰富的非必需氨基酸。此外,谷氨酰胺参与谷胱甘肽的合成,从而间接保护细胞免受自由基损伤,提高机体抗氧化能力。Wang等[14]研究发现,在饲粮中添加L-谷氨酰胺(1%和2%)可以改善犊牛十二指肠和空肠的形态,提高免疫力和抗氧化能力,缓解犊牛断奶应激,从而提高断奶犊牛的生长性能。Hu等[55]研究显示,饲喂L-谷氨酰胺(16 g/d)提高了犊牛十二指肠、空肠和回肠的生长率,增加了小肠绒毛高度和隐窝深度,以及CD4+T细胞、单核细胞的丰度和CD4+/CD8+的比率,表明外源性供应谷氨酰胺可增加断奶犊牛肝细胞的自噬水平。谷氨酰胺可改善断奶犊牛肠道健康并提高机体免疫力,表明谷氨酰胺能够作为体内的功能性抗氧化剂和能量补充剂应用于动物生产,缓解犊牛断奶应激。

丁酸是一种短链有机脂肪酸,是瘤胃中厌氧细菌碳水化合物发酵的主要终产物。丁酸可以向结肠细胞提供能量,并通过多种机制在这些细胞中充当细胞介质,促进肠道发育[56]。研究发现,断奶前在代乳粉或犊牛发酵剂中添加0.3%丁酸可提高犊牛的日增重、瘤胃乳头长度和宽度,促进瘤胃发育,改善犊牛的消化功能,降低腹泻率[57]。Koch等[58]研究发现,在饲粮中补充0.24%的丁酸盐可以调节断奶犊牛肠黏膜局部胰岛素样生长因子分泌,促进小肠黏膜的生长,从而提高小肠的成熟和吸收能力。此外,补充丁酸钠可以提高犊牛血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性,并降低丙二醛含量,表明丁酸钠可以改善犊牛的抗氧化能力[59]。因此,丁酸可通过促进犊牛瘤胃和肠道发育,降低腹泻率,缓解断奶应激,提高犊牛的生长性能。

3 小 结

断奶应激会损害犊牛机体健康,主要表现为胃肠道损伤、免疫功能障碍、生产效率下降。犊牛断奶应激通过改变胃肠道微生物区系和功能基因的表达对肠黏膜屏障产生损伤,从而影响犊牛的胃肠道和免疫功能。断奶应激引起激素水平的改变会引起细胞因子的分泌,从而造成自身免疫调节发生异常,引起炎症反应。此外,断奶应激可以直接通过营养物质的分解代谢水平影响犊牛生长性能。而补充益生菌和植物提取物等对缓解犊牛断奶应激、改善犊牛健康具有重要意义。目前,犊牛断奶应激的研究多集中于对机体的影响,但作用机理研究尚浅,未来还需要进一步深入研究断奶应激影响犊牛健康的作用机理,为通过营养物质调控缓解断奶应激提供科学依据。