陈正民　李乃树　刘子祥　姚超　孙发缔　许兆龙

【摘要】 目的：探討微小核糖核酸-7-5p（miR-7-5p）/成纤维细胞生长因子受体4（FGFR4）轴与胆囊癌病理特征、预后的关系。方法：选取蚌埠医学院第二附属医院2018年4月—2022年4月收治的胆囊癌患者108例为胆囊癌组，按照2∶1比例选取同期收治的良性胆囊疾病患者54例为良性组。比较两组miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达水平，分析二者表达与胆囊癌病理特征的关系。以患者入院第1天作为随访起始日，截至2023年4月30日，记录随访期间的生存率，分析miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达与胆囊癌预后的关系。结果：胆囊癌组miR-7-5p mRNA表达低于良性组，FGFR4 mRNA表达高于良性组，差异均有统计学意义（P<0.05），且胆囊癌患者miR-7-5p mRNA与FGFR4 mRNA表达呈负相关（P<0.05）。临床分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径≥3 cm、有淋巴结转移、低分化患者的miR-7-5p mRNA表达水平均低于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤最大直径<3 cm、无淋巴结转移、中-高分化患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。临床分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径≥3 cm、有淋巴结转移、低分化患者的FGFR4 mRNA表达水平均高于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤最大直径<3 cm、无淋巴结转移、中-高分化患者，差异均有统计学意义（P<0.05）。miR-7-5p mRNA高表达组生存率高于低表达组，平均生存期长于低表达组，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05）。FGFR4 mRNA高表达组生存率低于低表达组，平均生存期短于低表达组，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05）。COX回归分析提示，miR-7-5p mRNA表达增高是胆囊癌预后的保护因素，FGFR4 mRNA表达增高是胆囊癌预后的危险因素（P<0.05）。结论：胆囊癌组织中miR-7-5p mRNA表达下调，FGFR4 mRNA表达上调，二者存在相关性，且与临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度密切相关，是胆囊癌预后的独立影响因素，有望成为预测胆囊癌预后的重要指标。

【关键词】 胆囊癌 微小核糖核酸-7-5p 成纤维生长因子受体4 病理特征 预后

Relationship between miR-7-5p/FGFR4 Axis and Clinicopathological Features and Prognosis of Gallbladder Carcinoma/CHEN Zhengmin， LI Naishu， LIU Zixiang， YAO Chao， SUN Fadi， XU Zhaolong. //Medical Innovation of China， 2023， 20（33）： 00-007

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between microRNA-7-5p （miR-7-5p）/fibroblast growth factor receptor 4 （FGFR4） axis and pathological features and prognosis of gallbladder carcinoma. Method： A total of 108 patients with gallbladder carcinoma admitted to the 2nd Affiliated Hospital of BBMC from April 2018 to April 2022 were selected as the gallbladder carcinoma group， and according to the ratio of 2∶1， 54 patients with benign gallbladder disease admitted during the same period were selected as the benign group. The expression levels of miR-7-5p mRNA and FGFR4 mRNA were compared between the two groups， and the relationship between the expression and pathological features of gallbladder carcinoma were analyzed. With the first day of the patient's admission was taken as the start date of follow-up， and as of April 30， 2023. The survival rate during follow-up was recorded， and the relationship between the expression of miR-7-5p mRNA and FGFR4 mRNA and the prognosis of gallbladder carcinoma was analyzed. Result： The expression of miR-7-5p mRNA in gallbladder carcinoma group was lower than that in benign group， and FGFR4 mRNA expression in gallbladder carcinoma group was higher than that in benign group， the differences were statistically significant （P<0.05）， and miR-7-5p mRNA was negatively correlated with FGFR4 mRNA expression in gallbladder carcinoma patients （P<0.05）. The expression levels of miR-7-5p mRNA in patients with clinical stage Ⅲ-Ⅳ， maximum tumor diameter ≥3 cm， with lymph node metastasis and poorly differentiation were lower than those in patients with clinical stage Ⅰ-Ⅱ， maximum tumor diameter <3 cm， no lymph node metastasis and moderate-well differentiation， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expression levels of FGFR4 mRNA in patients with clinical stage Ⅲ-Ⅳ， maximum tumor diameter ≥3 cm， with lymph node metastasis and poorly differentiation were higher than those in patients with clinical stage Ⅰ-Ⅱ， maximum tumor diameter <3 cm， no lymph node metastasis and moderate-well differentiation， the differences were statistically significant （P<0.05）. The survival rate of the high expression group of miR-7-5p mRNA was higher than that of the low expression group， and the average survival time of the high expression group was longer than that of the low expression group， and the survivorship curve of the two groups was statistically significant （P<0.05）. The survival rate of the high expression group of FGFR4 mRNA was lower than that of the low expression group， and the average survival time of the high expression group was shorter than that of the low expression group， and the survivorship curve of the two groups was statistically significant （P<0.05）. COX regression analysis suggested that the increased expression of miR-7-5p mRNA was a protective factor for the prognosis of gallbladder carcinoma， and the increased expression of FGFR4 mRNA was a risk factor for the prognosis of gallbladder carcinoma （P<0.05）. Conclusion： The expression of miR-7-5p mRNA is down-regulated and FGFR4 mRNA expression is up-regulated in gallbladder carcinoma tissues， and the two are correlated. And they are closely related to clinical staging， tumor size， lymph node metastasis and differentiation degree. They are independent factors influencing the prognosis of gallbladder carcinoma， and are expected to be an important indicator for predicting the prognosis of gallbladder carcinoma.

[Key words] Gallbladder carcinoma miR-7-5p FGFR4 Pathological features Prognosis

First-author's address： The 2nd Affiliated Hospital of BBMC， Bengbu 233000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.33.001

胆囊癌是恶性程度较高的一种消化系统肿瘤，死亡率在各类恶性肿瘤中居第6位，但若能尽早确诊，及时行根治性手术，5年生存率较理想[1]。然而，胆囊癌早期发病隐匿，缺乏典型症状，当出现明显症状时，往往已发展为中晚期，错过最佳干预时机，预后欠佳[2]。临床必须寻求新的胆囊癌相关标志物与治疗靶点，为治疗提供依据，提高远期生存率，改善预后。研究表明微小核糖核酸（microRNA，miRNA）与肿瘤发生、进展密切相关，它能直接降解靶基因mRNA，或对蛋白翻译过程进行抑制，经转录后调控靶基因表达水平，参与细胞增殖、黏附、侵袭、转移、凋亡等过程，可通过作用于下游分子及相关信号通路，发挥抑癌或促癌作用[3]。既往研究发现，miR-7-5p可以通过靶向丝氨酸/苏氨酸激酶11的3UTR对非小细胞肺癌的A549细胞凋亡进行调控[4]。这表明miR-7-5p与肿瘤疾病存在关联，但与胆囊癌病理特征、预后的关系尚未彻底明确。另有研究指出，成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）能与其配体相互作用，参与肿瘤细胞的增殖、迁移等过程，FGFR4作为FGFR家族的成员，亦与肿瘤发生有关[5]。基于此，本研究旨在分析miR-7-5p/FGFR4轴与胆囊癌病理特征、预后的关系，进一步明确miR-7-5p与FGFR4的关系，以及二者在胆囊癌中的作用机制，为该病日后的治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

選取蚌埠医学院第二附属医院2018年4月—2022年4月收治的胆囊癌患者108例为胆囊癌组，按照2︰1比例选取同期收治的良性胆囊疾病患者54例为良性组。（1）纳入标准：胆囊癌组，①经手术病理证实为胆囊癌，且留取组织样本检测miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达水平；②年龄≥18岁；③精神状态及认知、表达能力正常，可配合随访。良性组，①良性胆囊疾病，同期于本院接受手术治疗，留取样本组织检测miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达水平；②年龄≥18岁；③精神状态、认知、表达正常。（2）排除标准：①同时患其他原发性肿瘤；②此次因胆囊癌复发入院接受手术治疗；③术前行新辅助放疗、化疗；④出血性疾病、心脏病、血液系统疾病；⑤肝、肾、脑等重要脏器功能不全。研究方案获本院医学伦理委员会批准。患者或家属对研究知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器与试剂 利用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测胆囊样本组织中miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达水平。主要仪器为离心机（Avanti JXN-30型，美国贝克曼库尔特有限公司）、PCR检测仪（ABI 7500型，美国ABI公司）、荧光定量PCR仪（LightCycler96型，瑞士罗氏公司）。主要试剂为Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、实时荧光定量PCR试剂（美国贝克曼库尔特有限公司）。

1.2.2 检测方法 通过手术获取样本组织，并存放在液氮内完全冷冻，研磨成粉末状，经Trizol试剂完全裂解，对总RNA进行提取，测定其纯度与浓度，存至低温环境（-80 ℃）。将RNA逆转录合成cDNA，引物采用Primer 5.0软件设计，以β-actin为内参，上、下游引物序列具体如下，（1）miR-7-5p：5-TAATGGTGTTGGGAATGATGGAAT-3、5-TTGGTGGGTGGGGTGGGAAAATA-3；（2）FGFR4：5-TATGGTGGGAAATGGATGGAT-3、5-TAATGGGTAGTGGAATGTTGTAT-3；（3）β-actin：5-TTTGTGGGGTGAATGTAAAATGG-3、5-TGGTGAAGTGGGGTGGAATG-3。PCR反应条件：95 ℃ 5 min（预变性）；95 ℃ 30 s（变性），62 ℃ 35 s（退火），72 ℃ 30 s（延伸），35个循环。根据2-ΔΔCt法确定目标基因的表达水平。

1.3 随访

以患者入院第1天作为随访起始日，截至2023年4月30日，采用电话/微信随访，记录患者的生存率，每3个月进行1次随访。

1.4 统计学处理

经SPSS 20.0软件统计数据。计数资料以率（%）表示，行字2检验；满足正态分布的计量资料以（x±s）表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行LSD检验，两组间比较行独立样本t检验；利用Kaplan-Meier法与log-rank检验进行生存分析；两计量资料的相关性采用Pearson线性相关分析；miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达与胆囊癌预后的关系采用COX回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

两组一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性，见表1。

2.2 两组miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达比较

胆囊癌组miR-7-5p mRNA表达低于良性组，FGFR4 mRNA表达高于良性组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。Pearson线性相关分析提示，胆囊癌患者miR-7-5p mRNA与FGFR4 mRNA表达呈负相关（r=-0.735，P<0.05）。

2.3 胆囊癌患者miR-7-5p mRNA表达与病理特征的关系

临床分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径≥3 cm、有淋巴结转移、低分化患者的miR-7-5p mRNA表达水平均低于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤最大直径<3 cm、无淋巴结转移、中-高分化患者，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。

2.4 胆囊癌患者FGFR4 mRNA表达与病理特征的关系

临床分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径≥3 cm、有淋巴结转移、低分化患者的FGFR4 mRNA表达水平均高于临床分期Ⅰ～Ⅱ期、肿瘤最大直径<3 cm、无淋巴结转移、中-高分化患者，差异均有统计学意义（P<0.05），见表4。

2.5 miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达与胆囊癌预后的关系

本次随访时间为12～36个月，中位随访时间24个月。（1）以胆囊癌患者miR-7-5p mRNA表达的均值2.45为界（≥均值为高表达，<均值为低表达），分为miR-7-5p mRNA高表达组（n=58）与低表达组（n=50）。结果提示，miR-7-5p mRNA高表达组生存率为74.14%（43/58），平均生存期32个月，低表达组生存率为42.00%（21/50），平均生存期26个月。miR-7-5p mRNA高表达组生存率高于低表达组，平均生存期长于低表达组，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（log-rank 字2=11.727，P<0.001），见图1。（2）以胆囊癌患者FGFR4 mRNA表达的均值34.69为界（≥均值为高表达，<均值为低表达），分成FGFR4 mRNA高表达组（n=61）与低表达组（n=47）。结果提示，FGFR4 mRNA高表达组生存率为47.54%（29/61），平均生存期28个月，低表达组生存率为74.47%（35/47），平均生存期32个月。FGFR4 mRNA高表达组生存率低于低表达组，平均生存期短于低表达组，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（log-rank 字2=7.429，P=0.006），见图2。

2.6 miR-7-5p mRNA、FGFR4 mRNA表达与胆囊癌预后的COX回归分析

在调整了性别、年龄、临床分期、肿瘤最大直径、淋巴结转移、分化程度、病理类型后，COX回归分析提示，miR-7-5p mRNA表达增高是胆囊癌预后的保护因素，FGFR4 mRNA表达增高是胆囊癌预后的危险因素（P<0.05），见表5。

3 讨论

目前，临床对胆囊癌诊疗已取得了一定进展，但由于早期诊断难度大，部分患者就诊时已出现早期淋巴结转移，甚至侵犯肝脏，即便行手术治疗，术后复发风险仍较高[6-7]。临床亟须进一步掌握胆囊癌的发病与进展机制，寻求新的治疗靶点。胆囊癌侵袭、转移过程非常复杂，涉及多种信号通路、效应因子、肿瘤微环境等因素[8]，但具体机制现阶段尚无定论。miRNA是非编码单链小分子RNA，能对各种生物过程进行调控，如调节细胞的增殖、分化、凋亡，并且参与了免疫应答、神经元发育等过程，与肿瘤发生、进展密切相关[9]。miR-7-5p则在多类恶性肿瘤中发挥了调控作用，且通过不同途径影响患者病情[10-11]，但关于其对胆囊癌的作用机制有待进一步探讨。FGFR4在肝癌等肿瘤组织中存在异常表达，参与了肿瘤血管形成过程[12]。通过分析miR-7-5p、FGFR4与胆囊癌进展、預后的关系，便于更深入掌握与之相关的治疗靶点。

本次结果发现，与良性胆囊疾病组织相比，胆囊癌组织中miR-7-5p mRNA表达下调，而FGFR4 mRNA表达上调，且在胆囊癌患者中二者呈负相关。研究指出miR-7-5p是一种肿瘤抑制因子，对肿瘤生长、侵袭有抑制作用[13]。王富霞等[14]发现，miR-7-5p能与聚合酶ε基因4[polymerase （DNA-directed） epsilon 4，POLE4]靶向结合，对非小细胞肺癌的肿瘤细胞增殖、侵袭、转移进行抑制。刘志洋等[15]研究提示，miR-7-5p能对POLE4表达进行靶向抑制，从而抑制神经母细胞瘤的增殖、侵袭。彭慧等[16]发现，食管癌组织中miR-7-5p呈低表达，Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4，KLF4）呈过表达，miR-7-5p能通过靶向抑制KLF4对食管癌细胞的增殖及转移能力进行调控。这进一步提示miR-7-5p具有肿瘤抑制作用，本研究亦证实miR-7-5p在胆囊癌组织中呈低表达，表明患者体内的抑癌作用削弱。FGFR4是FGFR家族的重要成员，亦是一种癌蛋白，FGFR4过表达可致Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylin-ositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）、Janus激酶/信号转导及转录活化因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等下游信号通路处于失调状态，增强肿瘤细胞的增殖、转移能力，这是FGFR4促进癌症进展的重要机制[17]。董庆旭等[18]指出，通过抑制FGFR4表达，能对口腔鳞癌细胞增殖进行抑制，促进肿瘤细胞凋亡，亦表明FGFR4的过表达具有促癌作用。本次发现miR-7-5p与FGFR4表达存在相关性，miR-7-5p能抑制胆囊癌细胞增殖，促进癌细胞凋亡，而FGFR4可促进癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡，故二者在胆囊癌患者中呈负相关。

本研究提示，miR-7-5p、FGFR4表达均与胆囊癌临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度相关，提示二者对胆囊癌进展有调控作用。miR-7-5p的主要靶基因为AKT1、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α基因（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic alpha polypeptide gene，PIK3CA）等[19]。FGFR4则可影响PI3K/Akt信号通路，与miR-7-5p存在相同靶基因，即二者具有相同下游信号通路。当miR-7-5p表达受到抑制后，FGFR4表达上调，胆囊癌细胞侵袭能力增强，促进病情进展，miR-7-5p/FGFR4轴可能通过上述机制，影响胆囊癌患者病情。本次结果提示，miR-7-5p高表达及FGFR4低表达患者的预后更好，远期生存率更高，总生存期延长，且二者均为胆囊癌预后影响因素。研究表明miR-7-5p联合miR-152-3p能对Wnt/β-catenin通路进行调控，影响乳腺癌的化疗耐药[20]，这提示miR-7-5p可影响肿瘤化疗效果，化疗效果则与预后密切相关。FGFR4能通过调控Wnt/β-catenin、PI3K/Akt、JAK/STAT等信号通路，产生促癌作用，导致病情进展，影响预后。miR-7-5p/FGFR4轴在胆囊癌进展中有重要调控作用，最终影响患者的远期生存率。

综上所述，miR-7-5p/FGFR4轴对胆囊癌进展有调控作用，与患者的肿瘤分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度和预后密切相关，二者均为胆囊癌预后的独立影响因素。但本研究也有不足，如最长随访时间为36个月，受研究时间限制，未能进行更远期的随访，之后还需延长随访时间予以观察。

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