田秦秦，卢先林，陈佳鑫，王海波，何 炜

(空军军医大学：1药学系化学制药学教研室，2基础医学院学员五大队二十队，陕西 西安 710032)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物体内调节生理和病理过程不可或缺的活性分子，起到重要的信使传递功能，能够为生命活动提供良好的氧化还原平衡环境[1-4]。作为细胞中第二信使的过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)为维持生理过程中的氧化还原平衡扮演着极其重要的角色，参与多种调控机体的生理过程[5]。研究表明，H2O2的异常表达会破坏生物体内的蛋白质、DNA和RNA，进而导致癌症、糖尿病、神经退行性疾病及心血管疾病的产生[6-9]。因此，开发高效的H2O2检测方法对于疾病的早期诊断与防治具有重要意义。相较于传统H2O2的检测方法[10-13]，荧光光谱法以其灵敏度高、特异性强、生物相容性优异、可实时监测和无创等优点被广泛应用于H2O2等ROS活性分子的检测应用，解决了操作复杂、仪器设备昂贵、干扰因素多等缺点[14-15]。基于H2O2的亲核性质，含有7-羟基香豆素、荧光素等结构的探针分子被应用于H2O2的特异性荧光检测。但这些荧光团存在激发波长和发射波长在可见光区等不足，不利于细胞或活体成像[16-17]。

二氢氧杂蒽(dihydroxanthene，DHX)类化合物自身具有长共轭结构且含多个可修饰位点，使得分子电子效应及水溶性易调控，长共轭体系易构建经典“D-π-A”结构分子，实现分子内电荷转移(internal charge transfer，ICT)调控。为此，一系列基于DHX结构的荧光探针实现了对H2O2长波长发射的荧光响应[18-23]。虽然，基于DHX结构的探针分子可以实现对H2O2的高效灵敏检测，但其仍然存在一定的局限性，比如检测限较高、缺乏细胞器靶向性、受生物分布及局部微环境干扰大等。因此，开发新型结构的探针分子以解决上述局限性问题实现对H2O2的高效灵敏检测，进而实现对相关疾病的监测及治疗评估至关重要。本研究基于前期对DHX型荧光探针的构建及生物学应用研究[24-25]，通过延长共轭的方式将具有功能化的吡啶盐引入DHX结构中构建“on-off”型线粒体靶向探针分子DHX-H2O2，具有选择性好、灵敏度高、细胞毒性低等优点，成功实现了对细胞以及斑马鱼中内源性和外源性H2O2的成像检测。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所涉及的化学和生物试剂均为市售化学纯或分析纯产品，除特殊说明外，均不需要进一步处理。人宫颈癌细胞系HeLa购自湖南丰晖生物科技有限公司。斑马鱼购自上海费曦生物科技有限公司。采用APEX Ⅱ FT-ICR高分辨质谱分析仪进行高分辨质谱(high-resolution mass spectrometry，HRMS)分析。在MERCURY-PLUS 400 MHz核磁共振波谱仪(Bruker公司)上进行1H NMR 和13C NMR分析。在UV-2700紫外分光光度计(日本岛津)上进行吸收光谱分析。在OmniFluo 900荧光光谱仪(卓立汉光)上进行发射光谱分析。在多功能酶标仪(Multiskan GO，赛默飞)上进行细胞活力测定。在IX81-FV1000 激光共聚焦显微镜(Olympus，日本)上进行细胞荧光图像。

1.2 方法

1.2.1 DHX-H2O2合成路线 化合物DHX-H2O2及其中间体化合物的合成路线如图1所示。

DMF：二甲基甲酰胺。DHX：二氢氧杂蒽。图1 DHX-H2O2的合成路线

1.2.1.1 化合物1的合成 将5.6 mL二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)和25 mL氯仿于0 ℃下搅拌，并缓慢加入PBr3(5.3 mL，65.0 mmol)，反应45 min后，加入环己酮(2.5 mL，24.2 mmol)，升至室温继续反应16 h后，将反应液倒入大量的冰水中，并用饱和NaHCO3调节溶液pH值至中性，二氯甲烷(dichloromethane，DCM)萃取，有机相无水Na2SO4干燥，除去溶剂，得棕黄色油状物化合物1[22]。

1.2.1.2 化合物2的合成 将2-羟基-4-甲氧基苯甲醛(3.6 g，26.6 mmol)溶于10 mL DMF中，逐滴加入化合物1的DMF稀释液(6.0 g，32.0 mmol)，再加入CsCO3(17.4 g，57.2 mmol)，抽真空氩气保护，室温下反应16 h后，加水淬灭，DCM萃取，有机相无水Na2SO4干燥，柱层析得亮黄色固体化合物2 5.8 g，产率50%[22]。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 10.30 (s，1H)，7.08 (d，J=9.0 Hz，1H)，6.65 (t，J=2.5 Hz，3H)，3.84 (s，3H)，2.55 (d，J=5.8 Hz，2H)，2.44 (t，J=6.2 Hz，2H)，1.71 (p，J=6.2 Hz，2H)。

1.2.1.3 化合物3的合成 4-乙腈吡啶(240.0 mg，2.0 mmol)、化合物2(242.0 mg，1.0 mmol)，溶于20 mL乙醇中，氩气保护下，加入0.1 mL哌啶，回流反应24 h后，除去溶剂柱层析分离得到棕色固体化合物3 187.0 mg，产率55%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.60 (d，J=8.0 Hz，2H)，8.16 (s，1H)，7.54～7.47 (m，2H)，7.06 (d，J=8.0 Hz，1H)，6.65 (d，J=8.0 Hz，2H)，6.58 (s，1H)，3.85 (s，3H)，3.01 (t，J=6.0 Hz，2H)，2.61～2.52 (t，2H)，1.84 (m，2H)。13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 161.3，155.0，153.9，149.9(2)，144.3，138.7(2)，127.3，127.1，126.0，119.4，119.0，115.1，110.8，109.9，100.6，100.5，55.7，29.6，26.0，21.0。HRMS (ESI-MS)m/z：C22H19N2O2+[M+H]+理论计算值343.144 1，实际值343.144 0(图2)。

A：1H NMR；B：13C NMR；C：HRMS。图2 化合物3结构表征

1.2.1.4 化合物DHX-H2O2的合成 化合物3(100.0 mg，0.3 mmol)、4-(溴甲基)苯硼酸酯(177.0 mg，0.6 mmol)，溶于20 mL乙腈中，氩气保护，回流搅拌24 h后，除去溶剂柱层析分离得到DHX-H2O268.0 mg，产率37%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.83～8.77 (m，2H)，8.59 (s，1H)，8.17 (d，J=4.0 Hz，2H)，7.81 (d，J=8.0 Hz，2H)，7.57 (s，1H)，7.43 (d，J=8.0 Hz，2H)，7.23 (d，J=8.0 Hz，1H)，7.10 (s，1H)，6.82 (d，J=8.0 Hz，1H)，5.77 (s，2H)，4.06 (s，3H)，3.04 (t，J=6.1 Hz，2H)，2.66 (t，J=5.9 Hz，2H)，1.86 (m，2H)，1.31 (s，12H)。13C NMR (100 MHz，CDCl3)δ 163.6 ，162.1，155.2，153.0，142.7(2)，142.5，136.0(2)，135.6，133.7，128.2(2)，127.9，126.4，121.2(2)，118.4，115.3(2)， 115.0，111.9，101.1，93.0，84.1(2)，62.8，57.6，29.1，25.5，24.9(4)，20.7。HRMS (ESI-MS)m/z：C35H36BN2O4+[M]+理论计算值559.276 3，实际值559.278 2(图3)。

A：1H NMR；B：13C NMR；C：HRMS。DHX：二氢氧杂蒽。图3 化合物DHX-H2O2结构表征

1.2.2 DHX-H2O2的光谱测试 在DMSO-PBS(体积比为1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)中，DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液于室温下放置180 min后进行紫外吸收光谱、荧光光谱的测试研究；DHX-H2O2(10 μmol/L)和不同浓度的H2O2(0～500 μmol/L)混合液于室温下放置180 min后进行不同浓度的荧光滴定实验；DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液在不同pH(pH值=2～13)条件下放置180 min后进行探针对pH的响应研究；DHX-H2O2(10 μmol/L)和H2O2(200 μmol/L)混合液直接进行荧光动力学测试，探究探针对H2O2的时间响应研究；在探针DHX-H2O2对H2O2的选择性研究中，其他ROS参照文献[20]方法制得母液。将DHX-H2O2(10 μmol/L)与H2O2(200 μmol/L)其余分析物(500 μmol/L)混合液于室温下放置180 min后进行选择性研究。所有荧光光谱除pH响应外均在DMSO-PBS(体积比为1∶1，10 mmol/L，pH=7.4)中进行，测试条件为λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX-H2O2在DMSO中制的1 mmol/L母液再稀释使用。

1.2.3 探针检测限的计算方法 根据荧光滴定所得到的探针在I675处的荧光强度变化，做出探针荧光强度对H2O2浓度变化的线性关系曲线，计算该曲线的斜率。利用公式LOD=3σ/k计算出探针对H2O2检测的检测限，其中σ为10次测量探针DHX-H2O2的I675荧光强度的标准偏差，k为线性关系曲线的斜率。

1.2.4 细胞成像实验

1.2.4.1 细胞毒性实验 将HeLa细胞置于含有100 mL/L胎牛血清和10 mL/L青链霉素合剂的DMEM完全培养液中，在50 mL/L CO2培养箱中37 ℃培养24 h。采用经典的MTT法研究探针DHX-H2O2对HeLa细胞的毒性大小。将HeLa细胞按每孔8×104/mL的细胞浓度，每孔200 μL细胞液加至96孔板中。然后在37 ℃、50 mL/L CO2的培养箱中孵育24 h，再分别加入0、10、20、30、40、50 μmol/L的探针溶液，将培养板继续培养24 h。孵育结束后，在每个孔板中分别加入20 μL(5 mg/mL)的MTT溶液，继续孵育4 h。将细胞上清液吸弃，然后每孔中加入150 μL DMSO溶液，将96孔板于摇床上低速震荡10 min，用酶标仪测A492 nm值，并计算细胞存活率。

1.2.4.2 细胞共定位实验 将适量细胞液移至激光共聚焦培养皿中，孵育24 h。随后，向培养皿中加入浓度为10 μmol/L Rh123染料培养液，培养30 min后，加入浓度为10 μmol/L的探针培养液，继续培养30 min。然后通过激光共聚焦显微镜对不同通道下的细胞进行成像扫描。

1.2.4.3 探针DHX-H2O2对细胞中H2O2的成像实验研究 实验分为5组。DHX-H2O2组细胞只用含5 μmol/L DHX-H2O2的DMEM培养液培养30 min；DHX-H2O2+50 μmol/L H2O2组和DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2组细胞先用相同的探针浓度培养30 min，然后分别加入50 μmol/L和100 μmol/L的H2O2溶液，共孵育30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L鱼藤酮组细胞先用0.1 μmol/L的鱼藤酮培养液孵育30 min，后加入5 μmol/L DHX-H2O2的DMEM培养液，继续培养30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L鱼藤酮+20 μmol/LN-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)为DHX-H2O2+0.1 μmol/L鱼藤酮组的对照组，将细胞先用0.1 μmol/L的鱼藤酮培养液孵育30 min，之后加入20 mmol/L NAC作抗氧化剂，用于清除ROS，继续培养1 h，清除细胞内ROS，后加入相同浓度的DHX-H2O2培养液，培养30 min。在激光共聚焦显微镜下进行细胞成像研究。

1.2.5 斑马鱼成像实验 将购置的斑马鱼卵放置于28 ℃培养箱内孵育，之后取5 d大的斑马鱼进行成像实验。实验分为3组：DHX-H2O2组用含10 μmol/L DHX-H2O2的培养液培养斑马鱼30 min；DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2组用含10 μmol/L DHX-H2O2的培养液培养斑马鱼30 min，再加入含100 μmol/L H2O2的培养液培养30 min；DHX-H2O2+0.1 μmol/L鱼藤酮组用0.1 μmol/L鱼藤酮培养液培养斑马鱼30 min后，用含10 μmol/L DHX-H2O2的培养液培养30 min。在激光共聚焦显微镜下进行细胞成像研究。

2 结果

2.1 探针DHX-H2O2的光谱性质

首先测试了探针DHX-H2O2(DMSO和PBS体积比为1∶1，10 mmol/L，pH值=7.4)与200 μmol/L H2O2反应前后的紫外与荧光光谱。通过吸收光谱发现，探针分子在596 nm和643 nm表现出两组最大吸收峰。与H2O2作用后，导致最大吸收峰发生了明显的蓝移，且在496 nm处产生了新的吸收峰，并且体系的颜色从蓝色变为粉色，表明探针具有裸眼检测H2O2的特性(图4A)。探针在590 nm光源的激发下，在675 nm处存在强的近红外荧光信号(图4B)。与H2O2作用后，在675 nm处荧光强度发生了显著的减弱。随着H2O2浓度的增加(0～500 μmol/L)，675 nm处荧光逐渐减弱(图4C)，并在H2O2浓度范围为140～180 μmol/L时存在优异的线性关系，由此可实现对H2O2的荧光定量测定。根据探针在675 nm的荧光信号与H2O2浓度的线性关系，得到线性方程：Y=-99.27X+27 355.2(R2=0.995)，并且由公式LOD=3σ/k计算出该探针对H2O2的检测限为4.21 μmol/L(图4D)。

A：探针DHX-H2O2与H2O2响应前后的吸收光谱；B：探针DHX-H2O2与H2O2响应前后的荧光光谱；C：探针DHX-H2O2对不同浓度H2O2响应的浓度滴定曲线；D：探针DHX-H2O2在675 nm处荧光强度比值与H2O2浓度的线性关系。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氢氧杂蒽。图4 探针DHX-H2O2的光谱性质

从以上结果可以说明，探针本身具有近红外荧光发射性能，还可以实现对H2O2的近红外荧光响应及裸眼观测，具有优异的灵敏度，可以用于H2O2的定量检测。

2.2 探针DHX-H2O2对pH响应测试研究和对H2O2的动力学研究

为了验证生理条件下探针DHX-H2O2是否可以实现对H2OH2O2的灵敏响应，我们测试了探针在不同pH环境下对H2O2的荧光响应。探针在酸性条件下于675 nm处的荧光信号稳定，当pH值>10时，675 nm处的荧光强度发生明显减弱，说明了强碱环境会破坏探针分子的结构，使其荧光信号不稳定(图5A)。此外，探针在生理条件下(pH值=6～8)的荧光信号并没有发生显著的减弱，表明探针可以实现生理条件下对分析物的荧光检测。与H2O2作用后，探针在生理条件下的荧光强度产生了显著的变化。因此DHX-H2O2可以实现生理条件下H2O2的检测。

A：不同pH条件下探针DHX-H2O2(10 μmol/L)与H2O2(200 μmol/L)响应变化；B：探针DHX-H2O2(10 μmol/L)及与H2O2(200 μmol/L)响应的动力学测试。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氢氧杂蒽。图5 探针DHX-H2O2的pH响应及动力学研究

接下来，在590 nm激发光照射下，研究探针在675 nm处荧光信号随时间变化的动力学曲线(红色)以及加入200 μmol/L H2O2时荧光信号随时间变化的动力学曲线(黑色，图5B)。结果表明，纯探针溶液在675 nm处荧光强度基本上不会随着时间的延长而发生明显的变化，说明了探针具有稳定的荧光信号输出。而且加入H2O2会使探针的荧光信号随着时间的延长发生明显的减弱，并在反应3 h左右达到最低且平衡。

2.3 探针DHX-H2O2的选择性研究

由于生命系统内环境复杂且活性物质较多，荧光探针在实际应用过程中应具备高选择性。因此，我们研究了探针DHX-H2O2对各种分析物的荧光响应变化，以此评价探针的检测特异性，主要包括各种不同的氨基酸(Cys、Hcy、GSH、Leu、Phe、Thr、Lys、Ala、Gly、Tyr、DTT)，ROS(ClO-、H2O2、ClO4-、TBHP、·OH、1O2、ONOO-、NO)以及其他常见的阴离子(F-、Br-、Cl-、S2O52-、CO32-、NO2-、S2O42-、PO43-、HPO42-、HS-、SCN-、HSO3-、S2O32-)。其中，H2O2浓度为200 μmol/L，其他物质的浓度为500 μmol/L。S2O82-、HS-、HSO3-、DTT、S2O52-这五类物质也会导致探针在675 nm处的荧光信号发生显著的减弱，而对于其他分析物，未观察到明显的荧光强度变化(图6)。

探针DHX-1与不同物质在675 nm处荧光强度数值变化柱状图。1：Thr；2：Lys；3：Ala；4：HPO42-；5：CO32-；6：Phe；7：GSH；8：Br-；9：Gly；10：HPO42-；11：SCN-；12：Leu；13：Cys；14：Cl-；15：ClO-；16：S2O32-；17：F-；18：ClO4-；19：Tyr；20：NO2-；21：TBHP；22：·OH；23：1O2；24：ONOO-；25：NO；26：DTT；27：HS-；28：S2O52-；29：S2O42-；30：H2O2；31：HSO3-。λex=590 nm，λem=675 nm，slitband：3 nm/5 nm。DHX：二氢氧杂蒽。图6 探针DHX-H2O2的选择性研究

但裸眼观测显示，这五类物质与探针作用后，体系颜色由蓝色转变为黄色，与H2O2和探针作用后所产生的体系颜色变化有明显不同，推测其可能的反应位点为吡啶环和DHX之间的共轭双键进行亲核加成反应，导致探针结构中的供体和受体之间的共轭被打破，致使探针在675 nm处的荧光强度发生了显著的变化。以上结果表明，虽然其他检测物质在675 nm处存在荧光强度减弱现象，但其作用机制不同，并且反应前后体系颜色变化亦与H2O2响应存在明显差异，所以表明探针DHX-H2O2对H2O2存在特异性响应。

2.4 探针DHX-H2O2对H2O2的识别机制研究

探针DHX-H2O2具有典型的D-π-A结构，其中，甲氧基部分为电子供体部分(D)，吡啶盐部分为受体部分(A)，通过分子内的共轭体系形成了具有强的ICT效应。结构中苯硼酸酯基团既作为H2O2识别基团，又与吡啶盐部位作为调控探针荧光性能的受体基团。吸收光谱表明探针与H2O2反应后的最大吸收波长与化合物3的最大吸收波长吻合。因此，推断探针与H2O2的反应产生的物质可能为化合物3，其反应机制主要分为两部分：①H2O2将硼酸酯键氧化脱除，形成酚氧负离子中间体；②酚氧负离子中间体不稳定，通过水解和1，6-消除反应脱除。此外，芳基苯硼酸酯基团被脱除后，会导致ICT效应变弱，进而荧光强度发生显著减弱(图7A)。

A：探针DHX-H2O2对H2O2可能的响应机制；B：探针DHX-H2O2与H2O2响应前后分子轨道能量及电子云密度分布。DHX：二氢氧杂蒽；DFT：密度泛函理论。图7 探针DHX-H2O2对H2O2的响应机制以及DFT计算

基于此，我们通过Gaussian 16软件对探针DHX-H2O2和化合物3进行了密度泛函理论(density functional theory，DFT)计算，通过探针反应前后轨道能量及电子云密度的变化进一步考察反应前后ICT效应的变化。探针DHX-H2O2轨道能隙差(2.38 eV)小于化合物3轨道能隙差(2.97 eV)，说明探针DHX-H2O2反应前后的ICT效应减弱，导致了探针在675 nm处的荧光强度发生减弱，与实验测试结果一致(图7B)。

2.5 探针DHX-H2O2对H2O2检测的细胞成像研究

2.5.1 细胞毒性实验 MTT实验评价探针DHX-H2O2的细胞毒性。结果表明，随着细胞培养液中浓度的增加，细胞的存活率呈现减小的趋势，但是即使探针浓度达到50 μmol/L时，HeLa细胞培养24 h后的存活率依然能够达到80%以上(图8)。说明探针DHX-H2O2具有较低的细胞毒性，为后续DHX-H2O2对活细胞中H2O2的成像检测提供有力支持。

DHX：二氢氧杂蒽。图8 探针DHX-H2O2对HeLa细胞的毒性实验

2.5.2 探针DHX-H2O2的共定位实验 由于生物体内ROS多发于细胞线粒体中，另外线粒体膜电位具有负电性，能够与带有正电的物质产生静电引力作用。因此，考察探针DHX-H2O2是否具有定位线粒体的靶向功能，我们进行了探针的线粒体共定位实验。如图9所示，细胞经探针DHX-H2O2和市售的线粒体染料Rh123共孵育后，探针与Rh123分别在不同通道实现了对细胞的染色，且互不干扰。通过对红色通道和绿色通道图像叠加，我们发现重合得到的图片表现出清晰明亮的黄光。这表明探针DHX-H2O2和线粒体染料Rh123在细胞内的分布区域相一致，通过计算得出皮尔森系数Rr=0.97(图9)。研究结果表明，探针DHX-H2O2可以定位于细胞中的线粒体亚细胞器，并可以用于后续实现对线粒体中H2O2的成像检测。

A：线粒体绿色荧光探针Rh123(10 μmol/L)对细胞孵育30 min后在绿色通道下的细胞成像[λex=488 nm，λem=(500±45)nm]；B：探针DHX-H2O2(10 μmol/L)对细胞孵育30 min后在红色通道下的细胞成像(λex=559 nm，λem=575～675 nm)；C：Rh123与探针DHX-H2O2细胞成像图叠加；D：Rh123与DHX-H2O2强度的相关图。标尺为50 μm。DHX：二氢氧杂蒽。图9 探针DHX-H2O2的共定位实验

2.5.3 探针DHX-H2O2对细胞中H2O2成像实验 随后，我们探究了探针DHX-H2O2对HeLa细胞中H2O2的成像功能。首先，我们将5 μmol/L的探针培养液与HeLa细胞共孵育30 min，发现红色通道产生了明亮的红色荧光，说明该探针具有对细胞成像的性能。而且，当在细胞中加入50 μmol/L和100 μmol/L的外源性H2O2刺激时，红色通道的荧光信号发生淬灭，并且随着外源性H2O2浓度的增加，红色通道的荧光逐渐减弱。此外，当细胞中加入探针及鱼藤酮(可刺激细胞产生内源性ROS)时，在红色通道具有较弱的荧光信号。在此实验基础上，加入NAC(ROS清除剂)的实验组细胞在红色通道中可显示红色荧光(图10)。以上实验结果说明了，探针DHX-H2O2可以实现对细胞的近红外荧光成像，并且对活细胞中内源性和外源性H2O2成像检测效果显著。

DHX：二氢氧杂蒽；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸。λex=559 nm，λem=650～752 nm，标尺为50 μm。图10 探针DHX-H2O2在HeLa细胞中的成像实验

2.5.4 探针DHX-H2O2对斑马鱼中H2O2成像实验 为进一步验证探针DHX-H2O2的生物应用性，我们考察了探针在斑马鱼模型中对H2O2的检测与成像能力。DHX-H2O2组是经探针DHX-H2O2(10 μmol/L)的DMEM培养液处理的斑马鱼的共聚焦成像图，在红色通道表现出了显著的近红外荧光信号，说明探针可用于对活体动物的成像标记。DHX-H2O2+100 μmol/L H2O2组是斑马鱼经探针培养30 min后，再加入H2O2培养液(100 μmol/L)培养30 min，此时，红色通道出现明显的荧光信号减弱；DHX-H2O2+ 0.1 μmol/L鱼藤酮组是斑马鱼先经鱼藤酮培养液培养30 min后，加入同浓度探针培养液培养30 min，在红色通道观察到明显的荧光信号减弱现象(图11)。以上实验结果表明该探针能够实现对活体动物斑马鱼中外源性和内源性H2O2的成像检测能力，表现出了良好的活体生物成像应用能力。

DHX：二氢氧杂蒽。λex=590 nm，λem=650～752 nm，标尺为100 μm。图11 探针DHX-H2O2在斑马鱼中的成像实验

3 讨论

综上所述，基于DHX结构，本研究引入了具有功能化的吡啶盐基团，设计合成了一类新型近红外荧光探针DHX-H2O2，并用于H2O2的检测及应用研究。该探针以芳基苯硼酸酯基为H2O2的识别基团，能够以良好的选择性与优异的灵敏度(4.21 μmol/L)实现对H2O2的近红外“on-off”响应，并伴有肉眼可见的蓝色到粉色的颜色变化。通过对探针反应前后的DFT计算，进一步阐明了探针与H2O2反应过程的荧光信号变化是由于探针反应前后ICT效应减弱导致的。生物成像研究表明，探针DHX-H2O2具有定位细胞线粒体的性能，皮尔森相关系数为0.97。探针DHX-H2O2成功实现了对细胞以及斑马鱼中内源性和外源性H2O2的低毒性成像检测，为后续进一步研究H2O2在相关疾病中的机制及药理作用提供潜在的应用技术支持。