王唱垚，王华

·综述·

间充质干细胞衍生的胞外囊泡治疗肺部疾病的研究进展

王唱垚，王华

071002 保定，河北大学生命科学学院（王唱垚）；100850 北京，军事医学研究院辐射医学研究所（王唱垚、王华）

肺部疾病主要是指肺脏本身的疾病或者是疾病的肺部表现，大多是因暴露于污染的环境或是职业因素，引起的肺脏不同程度的损伤，因此肺部疾病具有较高的发病率。根据肺部疾病的发病过程不同可以将其分为慢性肺部疾病和急性肺损伤。无论是哪种肺部疾病，一般都会引起抗炎因子（促炎因子）和抗纤维化因子（促纤维化因子）的平衡紊乱，从而导致组织损伤[1]。目前针对不同肺部疾病，大多采用以抗菌类、抗病毒类、糖皮质激素等药物为主的对症治疗。针对部分气管、支气管疾病也可采用介入治疗，部分严重的肺部疾病则需选择手术治疗。这些治疗手段的疗效和预后尚需进一步提高，因此，亟需寻找新的治疗策略。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有组织修复和免疫调节作用。因此，针对哮喘、慢性阻塞性肺疾病等多种慢性炎症性肺部疾病，已开展了多项临床前及临床研究，证实了 MSCs 的安全性及初步有效性[2]。尽管 MSCs 的作用机制尚未完全阐明，但局部或全身给与 MSCs，能够通过分泌生物活性物质促进内源性修复途径的激活并调节免疫细胞，从而改善炎症和参与组织重塑过程[3]。这些释放的生物活性物质中就包括胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）。研究表明，MSCs 来源的 EVs 具有与 MSCs 相似的生物学功能[4]，且比 MSCs 的免疫原性低，组织渗透性高，致瘤性和栓塞形成等副作用小，因此 EVs 被认为是一种可替代 MSCs 的更安全的无细胞治疗产品，广泛应用于再生医学研究领域[5]。本文就 MSCs 衍生的 EVs 治疗肺部疾病的研究现状进行综述。

1 EVs

EVs 是由细胞释放到胞外空间的膜源性囊泡，直径从 50 nm 到 5 μm，在细胞间通讯中发挥关键作用。EVs 中包含着各种具有生物活性的生物分子，如蛋白质、脂质、DNA、mRNA、microRNAs 等。但 EVs 中的这些生物活性分子与亲本细胞中的表达并不完全相同。有研究分析了 MSCs 来源的 EVs 中近 400 种 miRNAs，发现与亲本 MSCs 相比，EVs 中 miR-148a、miR-378、miR-532-5p 和 let7f 四种 miRNAs 的水平显著升高。此外，MSCs 的蛋白表达谱、表达水平与 EVs 之间也存在显著差异，其中与血管生成、凋亡、凝血、细胞外基质重塑和炎症相关的蛋白质在 EVs 中的表达高于其亲本细胞[6]。EVs 既可以通过特异性受体-配体相互作用直接刺激靶细胞，也可以通过靶细胞对 EVs 的内吞、融合或吞噬，将生物活性脂质以及胞内 RNA 和蛋白质等生物分子转移到靶细胞来发挥作用[7-8]。在一项临床研究中（MEXVT 研究，NCT04313647），健康志愿者接受异体脂肪干细胞来源的胞外囊泡（haMSC-EV）雾化后，未观察到严重不良反应，提示 haMSC-EV 可能是未来可应用于临床治疗肺损伤疾病的新策略。

1.1 EVs 的生物学特征和分类

根据 EVs 的大小、分泌方式的不同可以将 EVs 分为外泌体、微囊泡和凋亡小体。外泌体是最小的 EVs，直径为 50 ～ 150 nm。外泌体的形成发生在核内体成熟为多囊体的过程中，当多囊体与质膜融合，多囊体内的腔内囊泡被释放到细胞外空间，就形成了外泌体[9]。外泌体含有一系列保守的蛋白质，包括四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81），热休克蛋白（Hsp60、Hsp70 和 Hsp90），TSG101 和 MHC I 类和 II 类分子，这些蛋白质常作为外泌体鉴定的标志物。

微囊泡的大小在 100 ～ 1000 nm，由质膜向外出芽产生。磷脂酰丝氨酸转位到外膜小叶，并通过肌动蛋白-肌球蛋白相互作用收缩细胞骨架结构形成微囊泡[10]。微囊泡含有大量的磷脂酰丝氨酸、胆固醇和与脂筏相关的蛋白质，并富含鞘磷脂和神经酰胺。其中二磷酸腺苷核糖基化因子6和囊泡相关膜蛋白3可以作为鉴定微囊泡的标志物[10]。

凋亡小体是 EVs 中最大的一类，大小为 1 ～ 5 μm，通过细胞死亡时凋亡细胞膜的特征性起泡和突起产生的。在接收到正常生理信号或致病过程触发的程序性细胞死亡时，膜发生起泡，形成凋亡突起。这些突起物分解形成凋亡小体，包含细胞器、核基因组 DNA、碎片状核酸等生物活性物质[11]。通常，巨噬细胞可以识别凋亡小体特异的质膜标记物，然后进行吞噬去除[12]。

1.2 EVs 治疗肺部疾病的作用机制

1.2.1 免疫调节和抗炎作用 免疫调节异常是许多肺部疾病的重要病理特征，MSCs 衍生的EVs 具有和 MSCs 相同的免疫调节能力。研究发现 MSCs 衍生的 EVs 可以以剂量依赖的方式抑制 B 细胞的增殖分化[13]。同样，EVs 也能够促进 T 细胞的激活，研究发现骨髓 MSCs 来源的EVs 能够诱导辅助性 T 细胞向 Th2 型细胞转化，抑制T 细胞向分泌 IL-17 的效应 T 细胞分化，并增加调节性T 细胞水平[14]。EVs 还可以上调调节性 T 细胞和效应T 细胞之间的比例，减少促炎细胞因子的释放，包括干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-1β，同时增加抗炎细胞因子的产生，如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-10 和前列腺素 E2[15]。除了对 B 细胞和 T 细胞具有调节作用之外，MSCs 衍生的 EVs 还能够将巨噬细胞从炎性 M1 表型极化为抗炎 M2 表型，来自脂多糖预处理的 MSCs 的 EVs 可以促进巨噬细胞向 M2 型极化，并上调抗炎因子的表达[16]。在细菌性肺炎小鼠模型中，MSCs 来源的微囊泡通过分泌角质细胞生长因子，并减少炎症因子的分泌，从而提高模型小鼠的存活率[17]。在高氧诱导的实验性支气管肺发育不良小鼠模型中，骨髓和脐带 MSCs 来源的外泌体能够通过调节肺巨噬细胞表型来减轻炎症、改善肺功能、减少纤维化和肺血管重塑、降低肺动脉高压，从而治疗高氧诱导的支气管肺发育不良[18]。此外，MSCs 衍生的 EVs 也可以通过恢复线粒体转录因子 A（recombinant transcription factor A，mitochondrial，TFAM）维持 TFAM-mtDNA 复合物的稳定，防止靶细胞 mtDNA 损伤和 mtDNA 向胞质泄漏，从而有效地减轻细胞的线粒体损伤和炎症[19]。

1.2.2 促进组织修复 肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞是多种疾病中最容易受到损伤的两种细胞，尤其是在急性肺损伤的情况下，这两种细胞的损伤很容易引起急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）并增加患者的死亡率。而 MSCs 衍生的 EVs 对这两种细胞的损伤均有着潜在的修复作用。EVs 可以将血管生成素-1（angiopoietin-1，Ang1）的 mRNA 转移到受损内皮细胞，降低炎症损伤的人肺微血管内皮细胞的蛋白质渗透性，阻止细胞骨架蛋白 F-肌动蛋白重组为“肌动蛋白应力纤维”，并恢复细胞紧密连接蛋白 ZO-1 和黏附分子连接蛋白 VE-钙黏蛋白[20]。MSCs 衍生的 EVs 对肺泡上皮细胞也有着一定的修复作用，EVs 可以增加被炎症因子损伤的肺泡 II 型上皮细胞的ATP并增加细胞存活率[17]。在芥子气引起的肺损伤模型中，骨髓 MSCs 来源的外泌体通过上调 G 蛋白偶联受体家族 C5 组成员 A 重组蛋白来调控 Yes 相关蛋白通路，促进 B 淋巴细胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和连接蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡，促进上皮细胞屏障功能的恢复[21]。目前关于 EVs 发挥组织修复作用的机制之一可能是通过促进血管生成，或诱导肝细胞生长因子、细胞外调节蛋白激酶和受细胞刺激作用激活的蛋白激酶等通路调控与凋亡、细胞骨架重组和缺氧相关的 mRNA 的表达[22-23]。

1.2.3 抗菌活性 肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌等细菌常常会引起细菌性肺炎，严重时也会引起 ARDS，更甚会导致死亡。MSCs 能够分泌一些抗微生物因子，如抗菌肽 LL-37，增强免疫细胞对细菌的吞噬[24]；MSCs 也可以通过抑制中性粒细胞凋亡，增强白细胞功能达到抗菌的作用[25]。而 MSCs 衍生的 EVs 也有同样的效果，在严重细菌性肺炎中，通过给与 EVs 可以降低细菌负荷[26]。MSCs 衍生的 EVs 也可以通过传递 miR-145 抑制多药耐药相关蛋白 1的活性，从而通过白三烯 B4/白三烯 B4 受体 1信号通路增强 LTB4 的产生和其抗菌活性[27]。此外，EVs 也可以将线粒体转移到损伤的巨噬细胞，增强其氧化磷酸化水平，促进巨噬细胞抗炎及吞噬表型，增强巨噬细胞对细菌的吞噬能力[28]。

1.2.4 改善肺纤维化 在一些炎症损伤引发的肺部疾病的慢性恢复过程中，会出现失调的肺纤维增生，导致细胞外基质蛋白过度沉积，缓慢发展为慢性间质性肺纤维化，导致肺功能下降。在许多实验性肺损伤模型中发现，MSCs 衍生的 EVs 对急性肺损伤后的肺纤维化具有抑制作用。在小鼠特发性肺纤维化模型中，给与 MSCs 衍生的 EVs 可以减少胶原沉积和炎症[29]。在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，骨髓 MSCs 衍生的 EVs 可以通过 miR-186 抑制 SRY 核转录因子 4及分泌型蛋白dickkopf-1的表达，从而抑制肌成纤维细胞分化，改善肺纤维化[30]。在急性肺损伤（acute lung injury，ALI）导致的肺纤维化过程中，MSCs 外泌体通过传递 miR-23a-3p 和 miR-182-5p，沉默核因子κB 激酶亚单位 β 抑制剂和破坏 κB 抑制因子激酶 β 亚基的稳定，进而抑制核因子 κB 和 hedgehog 通路，从而逆转 LPS 诱导的肺损伤和纤维化的进展[31]。此外，脂肪 MSCs衍生的 EVs 可以通过传递 let-7d-5p 抑制 TGF-β R1，减少 PM2.5 诱导的大鼠肺泡上皮细胞的凋亡和坏死，改善肺纤维化[32]。

2 MSCs衍生的胞外囊泡对肺部疾病的治疗

2.1 ARDS

ARDS是一种由肺炎、败血症、肺部损伤等因素引起的严重低氧性呼吸衰竭。其特征是肺泡毛细血管膜被破坏，大量中性粒细胞流入肺泡间隙，促炎细胞因子（趋化因子）水平升高，表面活性物质功能障碍，存在富含蛋白质的肺水肿液，导致严重低氧血症[3]。

对于 ARDS 的治疗，目前主要分为机械通气治疗和非机械通气治疗，非机械通气治疗主要包括肺水清除，补充肺泡表面活性物质，采用 β 受体激动剂、他汀类药物、糖皮质激素、抗凝剂等药物，但疗效尚不确定，在降低死亡率和改善预后方面没有明显效果[33]。实验发现，MSCs 衍生的 EVs 在细菌和病毒诱导的 ALI 引起的 ARDS 模型中显示出较好的治疗效果。通过流感病毒诱导猪 ALI 模型，在病毒感染 12 h 之后，利用猪骨髓 MSCs 衍生的 EVs 进行气管内注射治疗，结果发现病毒复制及散播减少，促炎细胞因子产生减少，从而减轻流感病毒引起的肺损伤[34]。在另一项研究中发现，在小鼠肺炎模型中，通过静脉注射人骨髓 MSCs 衍生的 EVs 可以减少炎症，增加受损的肺泡II型细胞内的 ATP 生成，提高小鼠存活率[17]。血管生成素-1（angiopoietins-1，Ang-1）是一种血管生成因子，参与肺损伤时内皮细胞的稳定，降低白细胞-内皮相互作用和内皮通透性。研究发现，MSCs 衍生的 EVs 可通过促进 Ang-1的 mRNA 向受损内皮细胞转移来恢复受损肺微血管内皮细胞的蛋白质通透性，减少肺部损伤引起的水肿[20]。MSCs 衍生的 EVs 能够通过肝细胞生长因子改善经 LPS 诱导的肺微血管内皮细胞的屏障功能[35]。此外，包装在 MSCs 衍生的 EVs 中的 miRNA 在减轻 ARDS 肺损伤中也发挥着关键作用。研究发现，MSCs 衍生的 EVs 可以通过传递 miR21-5p、miR30b-3p 和 miR146a 等来减弱炎症反应[36-38]，通过传递 miR27a-3p 调节巨噬细胞极化[39]。在一项新型冠状病毒肺炎（COVID-19）有关的呼吸窘迫综合征的临床研究中（DB-EF PHASEII-001），通过静脉注射异体骨髓 MSCs 来源的外泌体（ExoFlo）能够降低受试者的死亡率。

2.2 新型冠状病毒肺炎

COVID-19 由新型严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2）引起。新型冠状病毒重症和危重症患者，特别是老年人和患有基础疾病的患者，有较高的死亡风险[40]。COVID-19 的特征是过度激活的免疫功能，其中包括炎症过度反应和细胞因子风暴，它们会导致肺组织损伤、气体交换功能障碍、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能衰竭，甚至死亡。

COVID-19 的治疗除了针对不同症状治疗和给氧治疗外，也开展了一些针对免疫功能障碍的治疗，例如使用糖皮质激素[41]、白细胞介素-1 拮抗剂[42]、抗病毒特异性中和抗体[43]等。目前的研究表明，免疫调节治疗方案具有一定的有效性和耐受性，但仍需进一步实验进行验证。研究发现 MSCs 衍生的 EVs 在猪流感模型中具有减少病毒复制、抑制促炎因子分泌的作用[34]，因此 MSCs 衍生的 EVs 被认为是一种对抗新型冠状病毒的有效策略。在一项针对严重 COVID-19 患者的小型、非随机的临床研究中，评估了异基因骨髓 MSCs 来源外泌体的效果，结果显示出良好的安全性，并能够改善炎症、恢复血氧饱和、重建免疫[44]。在另一项临床试验中，对 COVID-19 肺炎患者进行 MSCs 衍生的外泌体雾化治疗，发现经 EVs 治疗后的患者肺部病变吸收明显加快、住院时间缩短、C-反应蛋白水平降低[45]。这些研究都提示 MSCs 衍生的 EVs 在 COVID-19 的治疗中能够发挥一定的作用，但是仍需要进一步的研究来评估 EVs 疗法的安全性和临床药理学，为制造、储存、治疗提供标准，然后这些治疗方法才能在全球范围内推广。

2.3 肺动脉高压

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PAH）是指肺动脉压力≥ 25 mmHg 而引起的肺循环血流动力学改变。PAH 是一种进行性疾病，其特征是肺动脉重塑、肺浸润增加、血管横截面积减少和肺血管阻力升高，最终导致右心衰竭和死亡[46]。

目前针对 PAH 的治疗主要采用抗凝药物、利尿剂、洋地黄等药物，但这些治疗方法并不针对异常的肺血管重塑和炎症，因此需要积极探索一种能够逆转肺血管重塑，抑制炎症，并促进血管再生的治疗方法。MSCs 衍生的 EVs 具有免疫调节、促进血管生成的功能，因此是治疗 PAH 的潜在方法。利用野百合碱诱导大鼠 PAH 模型，发现经尾静脉注射 MSCs 衍生的 EVs，能够改善平均肺动脉压、平均右心室压、减少右心室肥大和肺血管重塑[47]，上调受损肺血管紧张素转换酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）和 Ang 的表达水平[48]。研究发现骨髓 MSCs 衍生的 EVs 可以通过其携带的 miRNA 来抑制肺动脉高压的发展，例如可以通过 miR-191 抑制骨形态发生蛋白受体 2来修复野百合碱诱导的肺损伤[49]。

除了急性肺部疾病外，MSCs 衍生的 EVs 在慢性肺部疾病中也发挥着重要作用。

2.4 慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一种常见的、可预防的肺部疾病，其特点是黏液分泌过多、纤毛异常、气流阻塞、换气功能障碍和支气管炎，导致慢性炎症反应、持续的呼吸道症状和气流受限[50]。

目前对于 COPD 主要采用支气管扩张剂、抗氧化剂、吸入糖皮质激素等药物进行治疗，可以减少或消除患者的症状、提高活动耐力、减少急性发作次数和严重程度以改善健康状态，但对于重症患者，药物治疗的效果并不理想。研究发现 MSCs 衍生的 EVs 在实验性 COPD 模型中表现出很好的保护作用。建立慢性香烟尘雾诱导的 COPD 小鼠模型，发现 MSCs 衍生的 EVs 可以改善模型小鼠的肺功能，包括提高 O2饱和度、pH、PaO2，上调抗炎因子 IL-10 表达，下调 TNF-α 和 IL-12 等促炎因子的表达，减少肺浸润巨噬细胞、抗原呈递肺泡巨噬细胞和中性粒细胞总数并减轻炎症。MSCs 衍生的 EVs 还能够影响 DCs 的迁移和抗原呈递特性，这有助于抑制 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞的活化。此外，吸入 MSCs 分泌的 EVs 能够通过改善 COPD 患者的第 1 秒用力呼气容积、呼气峰值流量，减轻肺气肿，改善 COPD 患者的生活质量[51]。除了天然来源的 EVs 外，MSCs 连续穿过聚碳酸酯膜获得的人工纳米囊泡可以通过激活碱性成纤维细胞生长因子 2信号通路来改善肺气肿，并显示出比天然 EVs 更有效地促进肺再生的能力[52]。总之，MSCs 衍生的 EVs 作为新的潜在治疗产品，通过调节慢性炎症、抑制肺气肿和恢复功能失调的线粒体功能，为 COPD 的治疗提供了全新的思路。

2.5 特发性肺纤维化

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺部疾病，其特征是肺泡上皮细胞功能障碍、成纤维细胞增殖、细胞外基质重塑、细胞外基质胶原积累和间质炎症。组织纤维化主要是由促纤维化介质（主要是 TGF-β）的增加引起的，这种生长因子能够通过促进受损组织中成纤维细胞的激活和增殖，促进抗凋亡肌成纤维细胞的存活，并激活上皮-间充质转化来刺激细胞外基质成分的沉积[53]。

研究发现 MSCs 的细胞培养上清中含有一系列蛋白质，如纤连蛋白、基膜聚糖蛋白、骨膜蛋白等，能够促进人小气道上皮细胞修复[54]；通过增加 Treg 的数量，降低细胞毒性 T 淋巴细胞、抑制 α 平滑肌肌动蛋白表达，阻止肺纤维化进程[55]；通过减少羟脯氨酸沉积和抑制 TGF-β 信号传导激活，减轻肺纤维化[56]。因此 MSCs 来源的 EVs 具有潜在的治疗 IPF 的可能性。

2.6 哮喘

哮喘是一种常见的以气道狭窄和高反应性为特征的慢性炎症性疾病，其病理生理学特征是气道壁的慢性炎症，伴有黏液分泌过多、上皮脱落、胶原沉积增加以及气道平滑肌增生[57]。使用 β2肾上腺素受体激动剂联合吸入皮质类固醇能够在大多数哮喘患者中实现疾病控制。然而，严重哮喘患者可能对治疗产生耐药性，同时长期使用糖皮质激素也会引起内分泌代谢紊乱、高血压、糖尿病等并发症[58]。

近年来，越来越多的实验证明，MSCs 衍生的 EVs 具有治疗哮喘的潜力。在卵清蛋白诱导的哮喘模型中，MSCs 衍生的 EVs 可以通过减少嗜酸性粒细胞的数量，显示出与 MSCs 相似的减少肺部炎症和逆转受损组织重塑的能力，减少气道中的胶原纤维、肺组织中 TGF-β 的产生以及胸腺中 CD3+CD4+T 细胞的数量[59]，缓解 Th2/Th1 诱导的肺部炎症和气道高反应性[60]。此外，MSCs 衍生的 EVs 也能够通过增加哮喘患者外周血单核细胞中 IL-10 和 TGF-β1 的表达来促进调节性 T 细胞增殖[61]。总之 MSCs 衍生的 EVs 具有独特的免疫调节和促进气道重建的作用，为哮喘提供了一种新的治疗方法，但其具体作用机制仍需深入研究。

3 总结与展望

大量研究证明，MSCs 具有免疫调节和促进再生的作用，在干细胞治疗方面展现出广阔的前景。MSCs 衍生的EVs 具有与其来源 MSCs 相似的作用，并且具有更好的免疫相容性，更高的稳定性，可穿透血脑屏障，无潜在的成瘤风险等优点。实验表明，MSCs 衍生的 EVs 可以通过其携带的 miRNA、RNA 和蛋白质等内容物的转移而激活多种信号通路，从而有效地干预及治疗多种肺部疾病，但由于其成分复杂，不同 EVs 组分具体的分子机制尚不清楚，有待深入研究。

作为一种无细胞替代治疗产品，MSCs 衍生的 EVs 的研究仍处于起步阶段，许多问题尚需明确。虽然 MSCs 衍生的 EVs 在肺部疾病动物模型的治疗中有大量的实验结果，但在不同的实验中使用的 MSCs 衍生的 EVs 的质量标准不统一，剂量的量化方法不同，因此，使得不同研究之间比较较为困难。因此，需要进一步建立质量标准，明确 EVs 剂量的量化方法，以便在不同研究中 EVs 的治疗效果具有可比性。此外，MSCs 衍生的 EVs 的生产和制备操作也需要进一步标准化，为了将 EVs 从实验动物模型过渡到临床，需要进一步扩大 EVs 的生产规模。因此，在 MSCs 衍生的 EVs 应用于临床之前，还有许多技术问题需要解决。

目前关于 EVs 治疗肺部疾病的临床试验较少，仅见于治疗 COVID-19。另外，临床试验中入组病例数较少，且以非随机，非双盲设计为主，因此，所获得的临床数据尚需进一步扩大样本量及规范临床试验设计来进行验证。

MSCs 衍生的 EVs 具有强大的免疫调节和组织修复能力，为其在急性和慢性肺损伤的临床应用提供了可能。如果能够克服上述挑战，那么 MSCs 衍生的 EVs 作为许多肺部疾病的潜在治疗方法将具有光明的前景。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.009

王华，Email：18511712135@163.com

2023-04-19