郭建军，王 通，吴庆华，曾 静，袁 林

（1.江西省科学院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.临川区连城乡便民服务中心，江西抚州 344117）

纤维素是由D-葡萄糖基通过 -1,4-苷键联结而成的线状高分子量碳水化合物[1]，广泛分布于自然界，如林木[2]、种植业废弃物[3]和食草动物粪便[4]等都含有大量纤维素，是一种易获取且廉价的可再生资源。将天然的纤维素物质降解为葡萄糖，进而转化为生物燃料以及其他高附加值产品[5-6]，对于人类的可持续发展具有重要意义。目前，自然界含纤维素材料的利用大多通过物理或化学手段进行预处理使其结构和性能发生改变[7-9]，如酸或碱浸泡、蒸汽爆破等，但这些处理方式效率较低、能耗较大、污染较严重[10]；而若能使用纤维素酶进行降解[11]，既环保又高效，但是成本较高，耗时较长[12]。

纤维素酶是能将纤维素水解为葡萄糖的复合酶的总称[13]，包括多种内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶[14]，现已广泛应用于动物饲料、酿造[15]、果汁与蔬菜汁加工[16]、粮食加工、中草药有效成分提取[17]、纺织[18]、洗涤剂和造纸等生产领域。由于天然纤维素分子链内或链间存在大量氢键，导致其形成了髙结晶度的结构[19]，从而具有较高的机械强度和化学稳定性[20]，难以被分解利用。天然的纤维素酶产生菌产酶活性低[21]、酶系组分不完全是纤维素酶不能被广泛利用的主要原因[22]。因此，发酵生产高活性的纤维素酶具有重要的现实意义。目前研究较多的产纤维素酶微生物多是真菌，真菌产生的纤维素酶具有产酶量大、酶活性高和酶系组成丰富合理等优点[23]，同时分泌的胞外酶易于分离提纯和工业生产放大[24]。笔者以课题组实验室筛选保存的镰刀菌（Fusariumsp.）YL2[25]为研究对象，设计Plackett-Burman 试验，拟筛选出影响纤维素酶发酵的主要影响因子，结合响应面法试验设计进一步优化响应因子，从而确定最佳的纤维素酶液态发酵工艺参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌 种 镰刀菌（Fusariumsp.）YL2，保藏号为CCTCCM 2014551，由中国典型培养物保藏中心提供。

1.1.2 培养基 （1）基础种子培养基：葡萄糖 10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.05 g/L、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）8.0 g/L，自然pH 值，121℃灭菌30 min。（2）初始发酵产酶培养基：微晶纤维素10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、硫酸铵 5.0 g/L、磷酸二氢钾2.0 g/L、硫酸镁200 mg/L、硫酸锰50 mg/L、硫酸锌100 mg/L、硫酸铜50 mg/L，自然pH 值，121℃灭菌30 min。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法 在无菌操作条件下将实验室保藏的镰刀菌菌株YL2 小心接至PDA 培养基斜面上，30℃培养48 h 进行活化；挑取约1 cm2大小的活化后菌种块于装有100 mL 液体种子培养基的250 mL三角瓶内，摇床转速170 r/min，30℃培养30 h，作为种子液；按照试验设计，将种子培养液接入发酵培养基进行发酵培养，每组做3 个平行样。

1.2.2 粗酶液的制备与纤维素酶活力测定 （1）粗酶液的制备。将发酵液在6 000 r/min 条件下离心8 min，取上清液作为粗酶液。（2）羧甲基纤维素酶（CMC）活力测定。取1 支空白管加入一定稀释比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴灭活10 min 作为空白对照；另取3 支样品管分别加入粗酶液0.50 mL，再加入2.00 mL 经50℃预热10 min 的10 g/L 的CMC-Na溶液（用pH 值 4.8 的0.05 mol/L 的柠檬酸缓冲液配制），混匀后置于50℃水浴中反应15 min，迅速向各管加入DNS 试剂3.0 mL，沸水浴10 min，冷却后定容至15 mL 摇匀，以空白管（对照液）调零，测OD540值。（3）微晶纤维素酶（AVI）活力测定。取1 支空白管加入一定稀释比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴灭活10 min 作为空白对照；另取3 支样品管分别加入粗酶液0.50 mL，加入2.00 mL 经50℃预热10 min 的 10 g/L 的微晶纤维素悬液（160 r/min 湿磨48 h），混匀后置于50℃水浴中反应15 min，迅速向各管加入DNS 试剂3.0 mL，沸水浴10 min，冷却后定容至15 mL 摇匀，以空白管（对照液）调零，测OD540值。以上酶活均减去发酵液中的还原糖后计算酶活力。酶活力单位定义为：在50℃，pH 值4.8 的条件下，以1 mL 酶液在1 min 内分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定义为1 个酶活力单位（1 IU/mL）。

纤维素酶活力=[葡萄糖含量（mg）×稀释倍数]/[反应液中酶液用量（mL）×反应时间（min）]

1.2.3 响应面分析法优化发酵培养工艺 （1）单因素试验。培养基组分的优化：分别选取碳源、氮源、缓冲盐、金属盐、表面活性剂进行单因素试验，研究各因素对发酵产纤维素酶的影响；培养条件的优化，在已确定培养组分下培养36 h 后测定酶活力，依次考察培养基起始pH 值、培养温度、装液量、摇床转速、接种量和培养时间对菌株生长状况及产酶的影响。（2）Plackett-Burman 试验。在单因素试验的基础上，用Design-Expert 8.0 软件进行Plackett-Burman 试验设计，以微晶纤维素酶（AVI）作为响应值，筛选出主效应因子。每个因素选2 个水平，中心点试验3 次，共16 组试验。（3）最陡爬坡试验。根据Plackett-Burman 试验分析筛选出影响微晶纤维素酶活的显著因子，根据各因素效应值的大小确定变化的步长和上升路径，以酶活力为响应值设计最陡爬坡试验，找出显著因素最大响应区域，确定响应面分析的中心点。（4）响应面法试验设计。根据最陡爬坡试验的结果，采用Box-Behnken 法对镰刀菌YL2 发酵产纤维素酶条件进行响应面分析试验，包括设计3 因素5 水平共17 个析因试验和3 个中心试验，共20 组试验，每个试验点进行3 次重复。获得菌株产纤维素酶的最佳培养组分与条件，经发酵培养的时间曲线验证优化效果，并确定产酶发酵周期。

1.3 数据处理与统计分析

采用SPSS 软件进行单因素试验数据分析和绘图；PB 试验、最陡爬坡试验、中心组合试验均运用Design Expert 8.0.6 软件进行设计与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源对菌株产纤维素酶的影响 采用稻草粉、麸皮、微晶纤维素、糊精、葡萄糖、糖蜜和蔗糖等为碳源进行培养，由图1A 可知，不同碳源对镰刀菌YL2 产酶影响的差异较大，微晶纤维素、麸皮和稻草粉对产酶有明显的促进作用，采用稻草粉作为碳源时效果最好，CMC 活力为35.27 IU/mL，AVI 活力为2.46 IU/mL。由图1B 可知，随着稻草粉添加量的不断增大，酶活力呈现先增大后减小的趋势。当稻草粉添加量为25 g/L 时，CMC 和AVI 活力达到峰值，分别为36.87 和2.83 IU/mL。因此，初步确定稻草粉的添加量为25 g/L。

图1 不同碳源对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响

2.1.2 氮源对菌株产纤维素酶的影响 不同微生物对氮源的需求也有较大的差异。由图2A 可知，有机氮源比无机氮源更有利于菌体的生长。其中，有机氮源对产酶有明显的促进作用，采用豆饼粉作为氮源时效果最好，CMC 活力为37.03 IU/mL，AVI活力为2.58 IU/mL。由图2B 可知，当豆饼粉添加量为25 g/L 时，CMC 和AVI 活力均达到峰值，分别为38.71 和2.87 IU/mL。因此，选择豆饼粉添加量为25 g/L 比较适合。

图2 不同氮源对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响

2.1.3 不同盐对菌株产纤维素酶的影响 以初始发酵产酶培养基中的缓冲盐（磷酸二氢钾2.0 g/L）为基础，做不同的替代。由图3A 可知，柠檬酸氢二铵和乙酸铵对产酶有明显的促进作用，采用柠檬酸氢二铵作为缓冲盐时产酶效果最好，CMC 活力为39.26 IU/mL，AVI 活力为2.74 IU/mL。从图3B 可知，添加不同金属盐（1.0 g/L）对菌株产酶有正影响：Mg2+＞Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，而Ca2+和Al3+对菌株产酶存在负效应。最佳产酶金属盐为MgSO4，发酵液CMC 活力为40.51 IU/mL，AVI 活力为3.02 IU/mL。

图3 不同盐对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响

2.1.4 表面活性剂对菌株产纤维素酶的影响 由图4A 可知，当表面活性剂为蔗糖酯时，菌体发酵产酶效果最显著。表面活性剂添加量控制在合适范围内，将有利于提高产酶能力；当添加量为1.2 g/L 时酶活力达到峰值，CMC 活力为42.46 IU/mL，AVI 活力为3.26 IU/mL。因此，后续试验采用1.2 g/L 的蔗糖酯作表面活性剂。

图4 表面活性剂对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响

2.1.5 发酵条件对菌株产纤维素酶的影响 根据前面优化后的培养基组分，研究初始pH 值对菌株产纤维素酶的影响，结果如图5A 所示，起始pH 值为6.0 时产酶效果最好，CMC 和AVI 活力最高，分别为43.55 和3.34 IU/mL；当初始pH 值超过6.0 时酶活降低。研究培养温度对菌株产纤维素酶的影响时发现（图5B），当培养温度为30℃时，酶活力最高，CMC 和AVI 活力分别为44.78 和3.44 IU/mL，因此初步确定目的菌产纤维素酶培养温度为30℃。如图5C 所示，在500 mL 三角瓶装100 mL 培养基时能获得较佳的产酶效果，CMC 活力为45.31 IU/mL，AVI活力为3.48 IU/mL。当摇床转速为225 r/min 时，酶活力均达到峰值，CMC 和AVI 活力分别为46.75 和3.59 IU/mL（图5D）。考察接种量对菌株产纤维素酶的影响发现（图5E），当接种量为3%（V/V）时，酶活力均达到峰值，CMC 和AVI 活力分别为46.97和3.61 IU/mL。由图5F 可知，培养时间为6 d 时，酶活力达到顶峰，CMC 和AVI 活力分别为47.65 和3.66 IU/mL，当培养时间超过7 d 时，酶活力呈现缓慢下降趋势。

图5 不同培养条件对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响

2.2 Plackett-Burman 试验结果与分析

根据前期单因素试验结果，选取10 个对菌株发酵培养产纤维素酶影响较大的因素，通过Design Expert 8.0 软件进行N=12 的Plackett-Burman 试验设计，每个因素选高（1）、低（-1）2 个水平，每组试验设置3 个平行，考察它们对产纤维素酶的影响，筛选出显著性影响因子。Plackett-Burman 试验设计的因素和结果如表1 所示。

表1 Plackett-Burman 设计及结果分析

利用Design Expert 8.0 软件对表1 中的试验数据进行方差分析，结果如表2 所示，主效应“Prob ＞F”等于0.003 2 ＜0.05，表明该模型与试验值拟合良好。碳源（稻草粉）、表面活性剂（蔗糖酯）和初始pH 值 3 个因子满足“Prob ＞F”小于0.05，说明它们对产纤维素酶酶活有显著影响，可考虑作为主要因素进一步做响应面试验；其他因素的取值则根据各因素效应的正负，柠檬酸氢二铵、装液量和培养温度对产纤维素酶酶活的影响呈现负效应均取较低值，分别为2.0 g/L、80 mL/500mL、30℃；而豆饼粉、硫酸镁、摇床转速和接种量的影响呈现正效应均取较高值，分别为25 g/L、1.0 g/L、225 r/min、3%。

表2 Plackett-Burman 试验结果的方差分析

2.3 最陡爬坡试验结果与分析

根据这3 个因素效应大小的比例设定它们的变化方向和步长，其他各因素分别取各自的水平进行试验，确定中心点。最陡爬坡的试验设计及结果见表3。随着碳源（稻草粉）质量浓度、表面活性剂（蔗糖酯）质量浓度和培养时间3 个主要影响因素的不同变化，酶活力的变化趋势呈现先上升后下降的趋势，其中第5 组发酵培养条件对应的微晶纤维素酶（AVI）活力达到了最大值，达到5.15 IU/mL，相应变量接近最大响应区域，所以选取第5 组条件即稻草粉30.0 g/L、蔗糖酯1.4 g/L 和初始pH 值6.3 为中心点进行响应面的分析。

表3 最陡爬坡试验设计与结果

2.4 中心组合试验结果与分析

以最陡爬坡试验得到的中心点为基点，进行产纤维素酶活优化的中心组合设计，试验设计和结果见表4。利用Design-Expert 8.0 软件对中心组合试验数据回归过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型，进而寻求最优响应因子水平。拟合得二次多项式方程：Y=6.21 ＋0.465X1＋0.479X2＋0.379X3＋

表4 中心组合试验设计及结果

由表5 可知，回归模型F值为53.71，P＜0.001，说明该试验模型可以拟合试验数据；模型的决定系数R2为0.943，校正系数R2adj为0.894，说明该模型能够解释89.4%的试验数据变化，模型拟合度好；失拟项的F值为0.084，P=0.985 5 ＞0.05，说明失拟项不显著，即回归模型显著，该试验模型可信度高，可用来分析及预测最大值。

表5 回归模型的方差分析

由图6 可知，在一定范围内随着稻草粉浓度、蔗糖酯浓度和初始pH 值的增加，纤维素酶活力随之增加，当达到最大值后，随着各因素浓度的继续增加，纤维素酶活力逐渐降低；各因素之间不是简单的线性关系，这三者之间相互有交互作用，共同影响着纤维素酶的生物合成。这说明只有在各因素浓度适宜的条件下，纤维素酶活力才会达到最大值。

图6 稻草粉、蔗糖酯和初始pH 值对镰刀菌YL2 产纤维素酶的影响的响应曲面

基于上述模型，通过Design Expert 13.0 软件对回归方程求极值，得到此模型的最大值，X1=0.634，X2=0.531，X3=0.558，对应稻草粉、蔗糖酯的添加量分别为31.585、1.453 g/L，初始pH 值为6.412，此条件下AVI 酶活为6.75 IU/mL。

经过修正，选择稻草粉添加量31.6 g/L、蔗糖酯添加量1.45 g/L、初始pH 值6.4，进行3 次平行试验，获得AVI 平均活力为6.72 IU/mL、CMC 平均活力84.36 IU/mL，与模型预测值接近，说明该模型能较好地反映镰刀菌YL2 发酵合成纤维素酶的实际情况。

3 结论与讨论

试验优化了镰刀菌YL2 液体发酵生产纤维素酶的培养基，对比分析了稻草粉、麸皮、微晶纤维素及糊精等碳源，尿素、硫酸铵、豆饼粉及蛋白胨等氮源，柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐及不同金属盐等盐溶液对产酶的影响，并探讨了添加表面活性剂对镰刀菌YL2 液体发酵生产纤维素酶的影响，结果显示，碳源以稻草粉、氮源以豆饼粉、缓冲盐为以柠檬酸氢二铵、金属盐以硫酸镁为最适宜，表面活性剂以1.2 g/L 蔗糖酯最有利于菌株产酶。

在单因素试验的基础上，采用Plackett-Burman试验设计及响应面分析，利用Design-Expert 软件，对纤维素酶高产菌镰刀菌YL2 进行发酵工艺条件的优化。通过Plackett-Burman 试验筛选出影响产酶的3 个主要因素，即稻草粉（碳源）添加量、蔗糖酯（表面活性剂）添加量和初始pH 值。在此基础上通过最陡爬坡试验和响应面分析法进行回归分析，结果表明，当稻草粉添加量为31.585 g/L、蔗糖酯添加量为1.453 g/L、初始pH 值为6.412 时，酶活力最高，此条件下AVI 活力预测值为6.75 IU/mL。经过修正，最佳培养基配方为稻草粉31.6 g/L、豆饼粉25 g/L、柠檬酸氢二铵2.0 g/L、硫酸镁1.0 g/L、蔗糖酯1.45 g/L，在发酵培养基初始pH 值6.4、500 mL 的三角瓶中装液量为80 mL、摇床转速225 r/min、接种量3%、培养温度30℃的最优产酶条件下培养6 d，微晶纤维素酶（AVI）和羧甲基纤维素酶（CMC）酶活为分别6.72 和84.36 IU/mL。