王永欣，于冬冬，＊＊，庄 语，张欢欢，，滕迎春，晁利芹，魏星宇，范世东

（1. 河南中医药大学针灸推拿学院 郑州 450046；2. 河南中医药大学第三附属医院 郑州 450008；3. 河南中医药大学第一附属医院 郑州 450099；4. 河南中医药大学中医药科学院 郑州 450046）

顺铂（Cisplatin，DDP）是临床常用的铂类化疗药物，广泛运用于多种恶性肿瘤[1-3]，发挥杀死恶性肿瘤细胞作用的同时，也会对正常组织细胞造成严重的损伤，产生一系列毒副反应[4]。肾脏对DDP 敏感性高，易在肾近端小管上皮细胞蓄积致细胞发生氧化应激反应，高剂量给药或低剂量重复给药均能造成肾损伤[5-6]。近期研究表明核因子E2 相关因子2（Nuclear factor E2-related factor2，Nrf2）相关信号通路的激活在氧化应激中发挥重要作用[7-8]。研究发现对于铂类化疗药物引起的肝肾毒性，采用经皮穴位电刺激可有效延缓肝肾损伤的进程[9]。前期研究表明针灸对于化疗药物造成的肝肾氧化损伤具有干预作用，同时也能够抑制肝细胞凋亡，以及减轻骨髓抑制等[10-14]，由于化疗药物造成的损伤是多方面多系统的，我们发现针灸亦能对肾损伤起到良好的改善和保护作用，但机理研究较为薄弱，因此，本研究基于课题组前期结果，从不同层次观察针刺与艾灸干预后DDP 所致肾损伤小鼠中Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein- 1，Keap1）和Nrf2 含量，蛋白表达以及mRNA 相对表达的变化，进一步研究其内在的微观机制，说明针灸干预DDP 所致肾损伤潜在的保护作用机制，为临床应用及研究提供相关实验室依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

SPF 级雄性昆明小鼠40 只，5 周龄，体质量（30±2）g，济南朋悦实验动物繁育有限公司[SCXK（鲁）2019-0003]提供。分笼饲养于河南中医药大学动物实验中心，自由饮水及普通饲料喂养，适应实验室环境（温度20℃～25℃，湿度50%～60%,光暗周期12h/12h）3 天后，根据小鼠体重随机分为4组（空白组、模型组、针刺组、艾灸组），每组10 只。严格执行2006 年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》对本实验动物进行处理[15]。河南中医药大学实验动物伦理审查批准编号：DWLL2018030013。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：注射用顺铂（货号：AA1A1007B）,购于齐鲁制药有限公司；BUN、Scr 试剂盒（货号：C013-2-1、C011-2-1），购于南京建成生物工程研究所；NGAL、CysC 试剂盒（货号：EK0854、EK0679），购于博士德生物工程有限公司；Keap1、Nrf2 ELISA 试剂盒（货号：E20201202A、E20201125A），购于苏州卡尔文生物科技有限公司；Keap1 兔单克隆抗体、Nrf2兔多克隆抗体（货号：R26935、380773），购于成都正能生物技术有限责任公司；Keap1、Nrf2 二抗，购于郑州乐睿生物科技有限公司；SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（货号：JCPE001），购于西安晶彩生物科技有限公司；RNAzol®RT RNA Isolation Reagent、cDNA 第一链合成试剂盒、BlazeTaqTMSYBR® PCR 试剂盒（货号：QP020、QP056、QP031），购于美国GeneCopoeia 公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（JC-PD002），购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

主要仪器：毫针（规格：0.18 mm×13 mm），购于北京中研太和医疗器械有限公司；细艾灸条（规格：0.4 cm×12 cm），购于临湘市湖香艾生物科技有限公司；台式低速离心机（型号：TDZ5-WS），购于上海卢湘仪离心仪器有限公司；酶标仪（型号：Model 680）、PowerPac Basic 电泳仪电源（型号：1645050），购于美国Bio-Rad 公司；通用型电泳仪（型号：JY300C），购于北京君意东方电泳设备有限公司；高速微量离心机（型号：D2012plus），购于北京大龙兴创实验仪器股份公司；分光光度计（型号：NanoDrop 8000）、蛋白印迹智能成像系统（型号：Bright FL1000），购于赛默飞世尔科技公司；梯度 PCR 仪（型号：TP600），购于日本TaKaRa公司。

1.3 模型制备

查阅文献发现，造模方法为单次腹腔注射7.5～25 mg·kg-1的剂量[6,16]。参照孙妍[17]的给药剂量，并经过课题组多次预实验，以10 mg·kg-1剂量制备肾损伤模型，并佐以病理切片验证[12]，发现此剂量既能造模成功又无动物大量死亡。因此，本实验采用10 mg·kg-1剂量DDP 进行腹腔注射，诱导肾损伤小鼠模型，模型制备完成时间为24h。空白组小鼠同时段给予腹腔注射0.9% NaCl溶液。

1.4 干预方法

干预腧穴：选取大椎、肝俞、肾俞、足三里4 个腧穴，定位方法依据《实验针灸学》[18]；固定方法：小鼠俯卧固定于自制鼠板（由四肢展开的距离大小在木板上钉上距离适宜的钉子制成，布胶带缠绕塑料夹子固定四肢）上。针刺方法：采用0.18 mm×13 mm 一次性毫针（方向及深度：直刺3 mm；时间：留针6 min）；艾灸方法：采用0.4 cm×12 cm 细艾条悬灸（时间：每两穴灸3 min，共计6 min；距离：距离腧穴约2 cm），模型组及空白组每日陪同抓取、固定6 min，与针刺组及艾灸组同步；同时段连续干预5天。

1.5 组织取材

取材时间：实验第7天；取材步骤：①眼球取血，所采集的血液室温静置2 h 后，3500 r·min-1离心10 min，取100 μL 上层血清置于2 mL EP 管中，对样本标记后放置在-20℃冰箱保存备检；②颈椎脱臼处死，剖腹后，取左侧肾脏组织并去除结缔组织，生理盐水冲洗后，等分后分装于三份冻存管，其中两份在取材过程中液氮冷淬，取材完成后，干冰转运至-80℃冰箱保存备检Western blot 和RT-PCR，另一份转运至-20℃冰箱保存备检ELISA。

1.6 观察指标及方法

（1）ELISA 法检测小鼠血清中BUN、Scr、NGAL 和CysC 含量，肾脏组织中Nrf2 及Keap1 含量：血清样本取离心后上清液进行检测，肾脏组织样本加入适量生理盐水捣碎，离心10 min（3500 r·min-1）取上清；试剂盒从冷藏环境中取出后在室温平衡后方使用。余步骤严格按照说明书进行。

（2）Western blot 法测定小鼠肾脏组织中Nrf2 及Keap1 的蛋白表达水平：制备蛋白样品→酶标仪蛋白浓度测定→制胶→加样→聚丙烯酰胺凝胶电泳→转膜封闭→孵育一抗（1:500- 1:10 000 稀释一抗，4℃摇晃孵育过夜）→孵育二抗（1:5000 稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温摇动孵育2h）→洗膜→ECL化学发光显影（内参蛋白：β-actin，目标蛋白表达量：目标蛋白/内参蛋白，Image J软件测定条带灰度值）。

（3）Real-time PCR 法检测小鼠肾脏组织中Nrf2及Keap1 mRNA 相对表达：RNA 抽提（TRIzol 法）→反转录为cDNA（37℃孵育1 小时，反应结束后85℃灭活处理5 min，-20℃保存反转录产物待用）→定量PCR实验（引物序列如表1 所示，采用SYBR Green 荧光染料法，反应条件设定为：预变性：95℃ 10 min 1 Cycle，变性：95℃ 10 s 40 Cycle，退火：60℃ 20 s 40 Cycle，延伸：72℃ 15 s 40 Cycle）→PCR 数据分析（采用2-ΔΔCt法计算Keap1与Nrf2的相对表达量）。

表1 小鼠Keap1、Nrf2 mRNA引物序列

1.7 统计分析

数据分析使用SPSS 26 软件，作图使用GraphPad Prism 9 软件，数据采用均数±标准差（±s）表示，符合正态分布采用单因素ANOVA 分析，不符合正态分布采用非参数Kruskal Wallis 检验。用Levene 法进行方差齐性检验，若方差齐，采用LSD 法；若方差不齐，采用Tamhane法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL含量

与空白组比，模型组小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量显著增高（P<0.05）；与模型组比，针刺组和艾灸组小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量显著降低（P<0.05）。与针刺组比，艾灸组小鼠血清中BUN、Scr、CysC、NGAL 的含量差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1 各组小鼠血清BUN、Scr、CysC、NGAL含量（ELISA法，±s，n=6）

2.2 各组小鼠肾脏中Keap1、Nrf2含量

与空白组比，模型组小鼠肾脏组织中Keap1 的含量显著增高（P<0.05），Nrf2的含量显著下降（P<0.05）；与模型组比，针刺组和艾灸组小鼠肾脏组织中Keap1的含量显著降低（P<0.05），Nrf2 的含量显著升高（P<0.05）。与针刺组比，艾灸组Keap1、Nrf2含量差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

图2 各组小鼠肾脏Keap1、Nrf2含量（ELISA法，±s，n=6）

2.3 各组小鼠肾脏中Keap1、Nrf2蛋白表达水平

与空白组比，模型组小鼠肾脏中Keap1 蛋白表达水平显著增高（P<0.05），Nrf2 蛋白表达水平显著下降（P<0.05）；与模型组比，针刺组和艾灸组小鼠肾脏中Keap1 蛋白表达水平显著降低（P<0.05），Nrf2 的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与针刺组比，艾灸组Keap1、Nrf2 蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 各组小鼠肾脏Keap1、Nrf2蛋白表达水平（Western blot法，±s，n=6）

2.4 各组小鼠肾脏中Keap1、Nrf2 mRNA 相对表达含量

与空白组比，模型组肾脏组织中Keap1 和Nrf2 mRNA 表达升高（P<0.05）；与模型组比，针刺组及艾灸组肾脏组织中Keap1 mRNA 表达降低（P<0.05），Nrf2 mRNA 表达升高（P<0.05）。与针刺组比，艾灸组肾脏组织Keap1、Nrf2 mRNA 表达差异无统计学意义（P>0.05）。见图4。

3 讨论

化疗所致肾损伤以血尿、腰部疼痛、倦怠乏力等为主要临床表现。中医并无化疗所致肾损伤的文献记载，现代中医学者[19-21]以“益肾排毒”“滋阴清热”“补肾健脾”等为治则进行治疗，均取得一定疗效。正所谓“正气存内，邪不可干”、“邪之所凑，其气必虚”，因此在治疗该病时，需要调节肾脏的内环境平衡，宜行健脾、补肝、益肾之法。课题组提出“扶正固肾为主，兼顾疏肝健脾益胃，化瘀止痛”的治疗原则，经过近40年动物实验以及临床研究，总结出“扶正固肾”穴方（大椎、肝俞、肾俞、足三里）治疗化疗所致肾损伤[13,22-24]。大椎穴，又名“上杼”、“百劳”，首见于《素问·骨空论》，为督脉与六阳经的交会穴，称“诸阳之会”，统摄一身阳气，有祛邪外出、激发阳气、恢复正气的功效；肝俞穴，为肝之背俞穴，是肝之气血输注汇集之处，有清利肝胆、疏理肝郁、散结止痛、补益肝肾的功效；肾俞穴，为肾之背俞穴，肾中精气输注的部位，主治肾脏相关疾病，有调补肾气、补益精髓、益肾养阳的功效；足三里穴，为足阳明胃经的合穴，胃腑之下合穴，有生发胃气、健脾祛湿、补气生血的功效。诸穴合用可达肝肾同调、健脾益气，培元固本之功，可以改善化疗所致肾损伤，减少化疗所致不良反应，增加机体抗病能力。课题组[9,11]既往研究也证实“扶正固肾”穴方对DDP肝肾损伤模型小鼠具有保护作用。

近年来，针灸疗法在肿瘤防治上逐步集中在治疗肿瘤伴随症状或改善放化疗后的不良反应[25]。既往研究表明针灸能够通过抑制Notch 信号通路，对环磷酰胺致骨髓抑制小鼠起到保护作用[26-28]，但针灸是否对DDP所致肾损伤具有保护作用研究尚浅。BUN、Scr是反映肾功能的常用指标，并且NGAL、CysC在急性肾损伤早期具有较高的诊断价值[29]。本研究发现针灸干预DDP 肾损伤模型小鼠后，血清中BUN、Scr、CysC 及NGAL 含量明显降低，结果表明针灸通过改善DDP 模型小鼠肾功能，对肾损伤发挥保护作用。此外，研究结果中针刺与艾灸疗效无明显差异，但艾灸有优于针刺的趋势。

DDP 诱导肾损伤的机理主要是：机体摄入的DDP以肾脏为主要排泄器官，容易在肾脏中形成长时间、高浓度的蓄积环境，从而诱导机体大量产生活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）介导炎症、氧化还原以及细胞凋亡等应激反应，对机体肾脏组织造成损伤[30-34]。目前，顺铂肾毒性的机制尚未完全阐明，研究表明肾脏的氧化应激反应是DDP 所致肾损伤的重要发病机制之一[35]。在对氧化应激的生物学反应中，处于中心位置的是Keap1/Nrf2-ARE信号通路，它调节许多抗氧化基因的转录，保持细胞内环境稳定[36]。Nrf2是细胞抗氧化应激的关键蛋白，在正常情况下，处于胞浆中的Nrf2 处于非活性状态，与其抑制因子Keap1结合，被Keap1泛素化修饰，蛋白酶体系统持续将其降解[37]。在氧化应激状态下，Keap1 可以快速对细胞氧化还原状态做出相关反应，ROS 可通过修饰Keap1 的半胱氨酸残基，造成Keap1 对Nrf2 结合作用的不稳定[38]，Nrf2 脱离Keap1 的结合，快速进行核转移，与抗氧化反应原件（Antioxidant response element，ARE）结合，继而进行下游靶基因转录[39]。研究发现[40]梓醇干预DDP 肾损伤大鼠模型后，Nrf2 蛋白表达水平及mRNA 相对表达升高，Keap1 蛋白表达水平及mRNA相对表达降低，与本研究结果一致。本研究结果显示，与空白组比，模型组肾脏组织中Keap1 含量、蛋白表达水平及mRNA 相对表达升高，Nrf2 含量及蛋白表达水平降低，mRNA 相对表达升高；与模型组比，针刺组及艾灸组Keap1 含量、蛋白表达水平及mRNA 相对表达降低，Nrf2含量、蛋白表达水平及mRNA相对表达升高。提示DDP 所致肾损伤与Keap1/Nrf2 信号通路的抗氧化作用密切相关，针灸可通过介导Keap1/Nrf2信号通路提高DDP 小鼠肾脏抗氧化应激能力，以改善肾损伤。

综上所述，本研究以Keap1/Nrf2 信号通路为切入点，通过检测Keap1 和Nrf2 三个不同层次的表达结果可知，小鼠腹腔注射DDP 后，造成Keap1/Nrf2 信号通路失调，破坏肾脏细胞内环境稳态，使肾脏组织发生氧化应激反应。针灸干预后，小鼠血清中BUN、Scr、CysC 及NGAL 含量明显降低，小鼠肾脏组织中Keap1表达下降，Nrf2表达上升，使得Keap1/Nrf2信号通路趋于平衡，改善肾功能及肾脏组织氧化应激反应，减轻DDP 所致肾损伤。本研究从氧化应激角度阐释了针灸改善DDP 化疗所致肾损伤潜在的微观机制和信号途径。由于Keap1/Nrf2信号通路处于氧化还原系统中心位置，其相关作用机制仍需要深入研究。