李 莉，刘 茹，何 晶，陈 云，郭 娟，纪 可，刘 玲＊＊

（1. 湖北省中医院 武汉 430061；2. 湖北中医药大学附属医院 武汉 430061；3. 湖北省中医药研究院 武汉 430074）

失眠（Insomnia）是常见的睡眠障碍现象，长期失眠会影响生活、工作或造成恶性事故的发生[1]。失眠的发病机制较多，中医将失眠的病因归为郁、火、虚，并与心、肝、肾器官相关[2]。中医上失眠被分为七种类型[3]，根据不同类型的病症，皆有对应的中医汤剂治疗，可见中医药治疗失眠疗效显著[4-9]。失眠的非中医治疗方法为药物联合治疗和非药物治疗[10-12]。药物联合治疗常使用处方药，所有处方药都有副作用，仅能短期使用[13-15]。因此中医药在失眠治疗中具有重要意义。

本研究中温胆汤由半夏、竹茹、麸炒枳实、陈皮、炙甘草及茯苓6 种中药组成，每种中药均具有多种药理作用[16-21]。临床研究发现温胆汤加味治疗可改善睡眠质量[22-24]。临床数据显示十味温胆汤口服治疗失眠患者，治愈20例，好转166例[25]。温胆汤已在临床失眠研究中取得了大量的验证，但其具体的作用靶点尚未被揭示。

网络药理学是以生物学和药学为理论基础，对生物系统进行网络分析，选取特定信号节点进行新药设计和靶点分析的新学科[26-27]。复杂疾病的发生和发展涉及到机体调控网络中多个基因和信号通路，网络药理学以其“多基因，多靶点”的特点与复杂疾病的治疗理念相契合，通过阐述“药物-靶点-通路-疾病”间的复杂网络关系，进行药物作用机制研究。网络药理学研究策略具有整体性和系统性的特点，其与中药的多成分、多途径、多靶点协同作用原理相同，在中药的研究中得到了广泛应用和突破[28-31]。本文将参考网络药理学评价方法指南[32]，建立温胆汤-失眠-靶点互作网络，寻找温胆汤在失眠症中的核心靶点，并进行实验验证，为温胆汤及中药的失眠靶向治疗提供思路和方向。

1 材料

1.1 试剂

TRIzol（Ambion，15596026）来自上海赛默飞世尔科技（中国）有限公司，SYBR FAST qPCR Master Mix（KAPA Biosystems，KM4101）和反转录试剂盒（TAKARA，RR037Q）来自武汉友名生物技术有限公司，氯仿（10006818）、异丙醇（80109218）、无水乙醇（10009218）、二甲苯（10023418）来自上海国药集团化学试剂有限公司，伊红（E8090）、中性树脂（G8590）及苏木素（G1140）来自北京Solarbio，艾司唑仑片来自襄阳市华中药业股份有限公司。裂解液和BCA 试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器

PCR 仪（柏恒，GE48527），荧光定量PCR 仪（Bio-Rad，CFX-Connect 96），高速冷冻离心机（Icen-24R）和超微量分光光度计（Nano-300）来自杭州奥盛，微型涡旋混合仪（MTV-1），实验室超纯水器（吉百瑞，ROS-S15），旋转型睡眠剥夺仪（自制），石蜡切片机（RM2235），显微镜（DM1000）来自徕卡显微系统有限公司。

1.3 动物

30 只雄性KM 小鼠，SPF 级，伦理审查许可证号：SYXK（鄂）2018-0104，4-5 周龄，体质量20-25 g，购于三峡大学，动物实验符合湖北省动物管理委员会《实验动物伦理证》相关规定。

2 方法

2.1 TCMSP中药成分及对应靶点分析

利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP[33]，http://tcmspw-e.com）进行数据挖掘，收集温胆汤成分中活性成分及作用靶点。对比现有的研究方法[34-35]，选择人体口服生物利用度≥30%，药物相似性≥0.18，肠上皮Caco-2细胞渗透性>0 nm∙s-1，药物半衰期≥4 h，氢键供体数目≤5 个，氢键受体数目≤10 为筛选条件。在UniProt 知识库（UniProt Knowledgebase，UniProt，https://www.uniprot.org/）中收集筛选后靶点对应的基因。

2.2 蛋白质-蛋白质交互作用网络

使用基因/蛋白质相互作用平台（STRING[36]，https://cn.string-db.org/）分析靶点之间蛋白互作关系。统计所包含的节点、边数量、平均节点度、蛋白质-蛋白质交互作用网络（Protein-protein-interaction-network，PPI）富集P值。

2.3 基因本体功能分析

通过生物学信息注释数据库（Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery，DAVID，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）对靶点对应蛋白进行基因本体（Gene ontology，GO）分析，描述相应的生物学过程（Biological process，BP）、细胞定位（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF），将P≤0.05 设定为显著性基因富集的临界值，使用R软件进行作图。

2.4 京都基因与基因组百科全书通路分析

通过KEGG（https://www.genome.jp/kegg/）分析温胆汤靶点参与的重要通路，以Homo sapiens 为物种和P≤0.05选择核心通路。

2.5 温胆汤治疗失眠有效靶点筛选

利用人类基因数据库（Human gene database，GeneCards，https://www.genecards.org/）查找失眠相关靶点，通过Venny软件绘制失眠靶点和温胆汤靶点交集，得到温胆汤治疗失眠有效靶点。

2.6 核心基因分析

应用Cytoscape 3.6.1 软件构建可视化网络分析图并分析网络节点的拓扑参数，以≥2 倍度的中位数、≥1 倍的介数中心度和接近中心性的中位数进行筛选，此3 个数值越大表明靶点的重要性越大[37-39]。其中节点颜色越深代表度越大。

2.7 温胆汤制备

温胆汤组成：法半夏6 g、竹茹6 g、麸炒枳实6 g、陈皮9 g、灸甘草3 g、茯苓4.5 g、每剂含生药34.5 g。一煎加药材量8 倍的水，沸腾后煎40 min，过滤取汁，二煎加药材量6 倍的水，沸腾后煎30 min，过滤二煎所得滤液，混合后浓缩成1∶1药液，温胆汤低剂量组含生药0.5 g·mL-1，高剂量组含生药2 g·mL-1，4℃冰箱保存备用。本实验所用中药材均来自湖北辰美中药有限公司。中药材批号：法半夏（2019910203）、竹茹（202001017）、枳实（2019912101）、陈皮（202001022）、甘草（202001021）、茯苓（2020912102），中药材鉴定人：胡银桥，熊燕。温胆汤处方鉴定人：廖华容。

2.8 失眠小鼠模型构建

通过改良版水平转盘睡眠剥夺法构建失眠小鼠模型。使用亚克力塑料板构建睡眠剥夺箱（长：110 cm，宽：60 cm，高：40 cm），其底部固定有15 个圆柱形平台（直径：6.5 cm；高：8 cm），保持10 cm 纵向间距，13 cm横向间距，注入23-25℃水至平台下1 cm 处，保持水温。适应性饲养7 天后，将24 只待造模小鼠放置于睡眠箱平台上进行站立训练，当其即将进入睡眠时，由于肌肉松弛垂头触水或落入水中而惊醒，使其被迫保持清醒站立，早晚各拿出休息1 次，每次30 min，训练2周。以体质量、毛发、精神状态、饮食、粪便来进行睡眠剥夺的效应评价，每2天进行1次效应评价。

2.9 动物分组

随机挑选6 只作为对照组，剩余24 只构建睡眠剥夺模型，并随机分为4组：模型组、温胆汤低浓度组（含生药0.5 g·mL-1）、高浓度组（含生药2 g·mL-1）、艾司唑仑片组（0.15 mg·kg-1），每组6 只。于模型开始构建的第15天开始灌胃，每天1次，共7天，低、高剂量组及艾司唑仑片组分别灌胃0.5 mL 相应浓度的温胆汤剂或艾司唑仑片溶液，对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水灌胃。最后一次给药干预12 h 后，眼眶采血0.5 mL，离心收集血清。100 mg·kg-1戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠，收集小鼠脑组织，于甲醛溶液固定。动物实验均符合湖北省动物管理委员会《实验动物伦理证》的相关规定。实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2018-0104。实验动物合格证No.42010200003462。

2.10 苏木素和伊红染色

分别切取固定后小鼠脑组织中大脑皮层、海马组织CA1 区和下丘脑0.3 cm 厚度，将要切取的平面朝下放到塑料包埋盒底部，乙醇梯度脱水后浸蜡包埋。将包埋组织置于-20℃冷冻，切片厚度3 μm，水浴展片，载玻片捞片，65℃烤片，将三组切片脱蜡至水，苏木素染色3 min，伊红染色3 min，梯度酒精脱水，过二甲苯6 s，中性树胶封固，Leica Application Suite 图像系统采集样本相关部位。

2.11 实时定量聚合酶链式反应验证核心靶点

收集小鼠脑组织匀浆，温育5 min 后，离心，加入氯仿摇匀，室温静置2 min，离心收集上清，加入等体积的异丙醇，混匀，静置后弃上清；乙醇漂洗，干燥沉淀并加入DNase-Free Water 溶解。反转录条件42℃，60 min；70℃，15 min。在相应条件下进行扩增，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.12 Western blot验证核心靶点

将脑组织剪碎，4℃环境下加入裂解液裂解，12 000 r·min-1离心15 min，吸取上清液。BCA 试剂盒检测上清液中蛋白质浓度，SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h，PBS 洗涤3 次，加入一抗（AKT1、MAPK3、TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF），4℃孵育12 h，PBS 洗涤3 次。加入二抗，室温孵育1 h 后，PBS洗涤3次。曝光，灰度值分析。

2.13 统计分析

实验验证数据采用SPSS 23.0 统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，多组间的差异采用One-way Anova 分析，以P<0.05 具有统计学意义。

3 结果

3.1 TCMSP筛选温胆汤活性成分及对应靶点

在TCMSP 数据库中查询获得103 个温胆汤活性成分，根据条件筛选得到99 种活性成分。其中5 种活性成分属于陈皮、68种活性成分属于甘草、9种活性成分属于半夏、13种活性成分属于枳实、3种活性成分属于茯苓、1 种活性成分属于竹茹。在UniProt 数据库中查询这99 种活性成分，Venny 软件合并重复靶点后得到266个温胆汤的预测靶点，具体详见表2和图1。

图1 温胆汤的预测靶点Venny图

表2 温胆汤中活性成分对应靶点

3.2 温胆汤预测靶点GO功能分析

如图2 显示，在DAVID 网站中进行GO 功能富集分析获得温胆汤预测靶点2482 条目BP（P<0.05）、102条目CC（P<0.05）、227条目MF（P<0.05），其中基因富集条目最多的前3 个BP 分别为：药物反应（54 基因）、对氧化应激的反应（52基因）、细胞对化学压力的反应（47 基因）；基因富集条目最多的前3 个CC 分别为：膜筏（35 基因）、微区膜（35 基因）、突触膜（27 基因）；基因富集条目最多的前3 个MF 分别为：DNA 结合转录因子结合（31基因）、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合（26基因）、DNA 结合转录激活子活性（25基因）。

图2 温胆汤预测靶点GO功能分析散点图

3.3 温胆汤预测靶点KEGG通路分析

如图3 所示KEGG 富集分析显示温胆汤的预测靶点参与185 个信号通路（P<0.05），基因富集条目最多的前3个通路分别为：脂质和动脉粥样硬化（51基因）、PI3K-Akt 信号通路（44 基因）、化学致癌-受体激活（44基因）。

图3 温胆汤预测靶点KEGG通路分析散点图

3.4 温胆汤与失眠共同靶点分析

利用GeneCards 数据库检索失眠的相关靶点，共发现2587 个失眠相关靶点。Venny 软件分析温胆汤预测靶点与失眠相关靶点，最终得到119 个共同靶点（图4）。

图4 温胆汤化合物与失眠靶点交集

3.5 温胆汤与失眠共同靶点PPI分析

应用Cytoscape 3.6.1 软件构建可视化网络，分析共同靶点。使用Network Analyzer 分析网络节点的拓扑参数，以≥2倍的中位数及≥1倍的介数中心度和接近中心性的中位数进行筛选，发现共同靶点中心度从大到小的顺序为：AKT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3、MMP9、MAPK3（图5）。使用STRING网站分析共同靶点之间的蛋白互作关系，生物体选择小鼠，最低要求的交互置信度（Minimum required interaction score）选择最高自信度，一共产生115 个节点，165 条边，平均节点度为2.87，PPI富集P<1.0e-16，所有蛋白结合分值均大于0.9。边条目最多的是Trp53，一共有19 条边，边条目排名前十的靶点详情见表3。使用k均值聚类算法将115 个节点聚集为2 类，去除没有边连接的蛋白后得到图6 所示的共同靶点PPI 网络。根据共同靶点中心的基因和边条目数量排序，温胆汤治疗失眠的核心靶点有AKT1、TNF、IL-6、TP53、CASP3等（图7）。

图5 Network Analyzer分析共同靶点

图6 共同靶点PPI网络

图7 温胆汤治疗失眠核心靶点分析图

表3 共同靶点PPI分析边条目

3.6 温胆汤与失眠共同靶点GO功能分析

如图8 显示，在DAVID 网站中进行GO 功能富集分析获得共有靶点1929 条目BP（P<0.05）、70 条目CC（P<0.05）、168 条目MF（P<0.05），其中基因富集条目最多的前3 个BP 分别为：药物反应（29 基因）、对氧化应激的反应（27 基因）、金属离子的响应（26 基因）；基因富集条目最多的前3 个CC 分别为：膜筏（19 基因）、微区膜（19 基因）、突触膜（17 基因）；基因富集条目最多的前3 个MF 分别为：DNA 结合转录因子结合（15 基因）、神经递质受体活性（14基因）、RNA 聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合（14基因）。

图8 温胆汤核心靶点GO功能分析散点图

3.7 温胆汤与失眠共同靶点KEGG功能分析

如图9 所示KEGG 富集分析显示共同靶点参与156个信号通路（P<0.05），基因富集条目最多的前3个通路分别为：脂质和动脉粥样硬化（28 基因）、卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染（23基因）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（22 基因）。对比后发现核心靶点主要存在脂质和动脉粥样硬化通路中，在KEGG 网站中检索脂质和动脉粥样硬化通路（hsa05417），核心靶点所参与的通路分支分别为PI3K-AKT 信号通路、凋亡、p53信号通路（图10）。

图9 温胆汤核心靶点KEGG功能分析散点图

图10 温胆汤核心靶点通路聚集图

3.8 睡眠剥夺的效应评价与失眠小鼠模型鉴定

睡眠剥夺后小鼠精神状态较差，饮食饮水减少，毛发光亮度较差。随着睡眠剥夺时间的延长，体质量开始出现下降趋势（图11）在模型组中随机挑选6只小鼠与对照组小鼠进行睡眠剥夺的效应评价，评价结果详见表4-表7。模型组睡眠剥夺小鼠与对照组相比，大脑皮层出现明显的胞核皱缩，细胞排列杂乱，体积缩小；海马CA1 区细胞胶质细胞增生；下丘脑组织基质疏松，呈网状结构，皱缩的带形细胞数量增加，饱满角形细胞减少。结果表明小鼠睡眠被剥夺并引起脑组织损伤（图12）。

图11 睡眠剥夺期间小鼠体质量

图12 睡眠剥夺小鼠大脑皮层、海马CA1区和下丘脑组织HE染色（×200）

表4 睡眠剥夺后毛发效应评价

表5 睡眠剥夺后精神状态效应评价

表6 睡眠剥夺后饮食效应评价

表7 睡眠剥夺后粪便效应评价

3.9 小鼠体内核心靶点相关mRNA 和蛋白质表达水平变化

检测温胆汤低剂量和高剂量治疗前后小鼠脑组织中核心靶点表达水平（图13，图14）。与对照组相比，模型组小鼠脑组织中AKT1 和MAPK3 mRNA 表达水平和蛋白表达水平显著降低（P<0.05），TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF mRNA 表达水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比，低剂量组小鼠脑组织中AKT1 和MAPK3 mRNA 表达水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05），Caspase-3、VEGFA、TNF的mRNA 表达水平和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。此外，与低剂量组相比，高剂量组小鼠脑组织中TP53、Caspase-3、VEGFA、TNF 的mRNA 表达水平和蛋白表达水平显著降低（P<0.05），AKT1 和MAPK3mRNA表达水平和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。

图13 温胆汤对核心基因mRNA表达水平的影响

图14 温胆汤对核心基因蛋白表达水平的影响

4 讨论

本研究通过水平转盘睡眠剥夺法构建失眠小鼠模型，通过苏木素和伊红染色发现睡眠剥夺小鼠脑组织损伤。在失眠的治疗方法中，认知行为疗法、艾司唑仑、唑吡坦和苏伐雷坦的药物治疗可改善失眠症患者的临床症状，但是其临床意义、适用性、有效性和长期疗效性都不太清楚[40]。由于中医具有毒副作用小和治疗效果显著的特点，因此选用温胆汤进行失眠症的治疗具有重要意义。

研究发现温胆汤合半夏秫米汤加减疗法可以有效地改善睡眠质量[41]。对慢性胃炎合并失眠症患者实施温胆汤治疗效果显著[42]。温胆汤治疗慢性胃炎并失眠症，能够显著提高患者的治疗效果，对患者的睡眠质量产生良好的改善作用，具有较高的临床实践价值[43]。针刺联合加味温胆汤治疗痰热扰心型失眠临床疗效显著，可更加有效地改善患者临床症状，提高睡眠质量，值得在临床中推广应用[44]。耳穴联合温胆汤用于痰热内扰型失眠患者，可快速改善患者的症状及情绪状态[45]。脑梗塞后痰热内扰型失眠症应用温胆汤联合耳穴贴压治疗具有非常显著的临床效果[46]。运用温胆汤配合森田疗法干预治疗失眠症，无不良反应，无药物依赖，患者易于接受且疗效显著，适合临床广泛应用[47]。针对慢性胃炎并发失眠患者按照耳穴贴压以及参芪温胆汤相结合的方式展开治疗，可针对患者睡眠状态进行有效改善，利于恢复[48]。温胆汤对失眠症具有明显的治疗效果，并且温胆汤可以联合西药和耳穴来加强治疗效果。但是本研究的温胆汤与传统的温胆汤配方不同，并且温胆汤方剂中药复方能够治疗失眠症的具体作用靶点仍不明确。

在本研究中，利用中药系统药理学数据库与分析平台发现温胆汤中一共有103 个活性成分，其中甘草中的活性成分最多，通过筛选后仍然有99种主要的活性成分，而这些活性成分对应的靶蛋白有266 个。这提示温胆汤具有多种生物活性，每一味中草药均具有一定的生物活性，故温胆汤方剂中药复方中的半夏、竹茹、麸炒枳实、陈皮、炙甘草、茯苓都具有一定的生物活性。因此，只能通过分析温胆汤的生物学过程及其分子功能来进一步筛选核心靶点。

通过GO 功能分析发现温胆汤活性成分参与的生物学过程最多的为药物反应、细胞对化学应激的反应、对类固醇激素的反应、对金属离子的响应、活性氧代谢过程、对活性氧的反应；温胆汤活性成分的分子功能主要有DNA转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA 转录因子结合、调节神经递质受体活性。随后KEGG 通路分析发现温胆汤活性成分主要参与脂质与动脉粥样硬化信号通路、化学致癌-受体激活信号通路、乙型肝炎信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、卡波西肉瘤信号通路、人T 细胞白血病病毒Ⅰ型感染信号通路。但是脂质与动脉粥样硬化信号通路与药物反应和化学应激反应的关系并不紧密。因此要找到温胆汤与失眠症作用的核心靶点，需要结合失眠症的作用靶点进行分析。通过GeneCards 检索失眠的相关靶点，共发现2587个相关的靶点。通过分析温胆汤活性成分预测靶点与失眠预测靶点，发现温胆汤活性成分和失眠共有119 个共同靶点，这些靶点对应的蛋白之间存在1609 条作用关系。在Network Analyzer 中对共有靶点可视化分析，以≥2倍的中位数及≥1倍的介数中心度和接近中心性的中位数进行筛选发现共有靶点中的核心基因为：AKT1、TNF、IL-6、TP53、VEGFA、CASP3、MMP9、MAPK3。

研究报道AKT1 磷酸化会降低氧化应激刺激的MAP3K5 激酶活性，从而防止细胞凋亡[49]。促凋亡活性通过与PPP1R13B/ASPP1或TP53BP2/ASPP2的相互作用被激活[50]。LincRNA-p21 参与导致细胞凋亡的TP53 依赖性转录抑制，似乎对细胞周期调节有影响，通过抑制CLOCK-ARNTL/BMAL1 介导的PER2 转录激活来调节生物钟[51]。大脑生物钟的异常也是导致失眠的一个因素。MAPK3参与程序性细胞死亡过程，当细胞收到内部（例如DNA损伤）或外部信号（例如细胞外死亡配体）时开始，当执行阶段完成时，细胞已经死亡[52-53]。结合VEGFA 参与MAPK 的级联调控，推测温胆汤调节凋亡相关因子和信号通路的传导，来治疗失眠症。随后通过GO 功能分析和KEGG 功能分析发现，温胆汤与失眠的核心靶点参与的生物学过程为药物反应和氧化应激反应，并调节神经活性配体-受体相互作用通路。研究证实人类睡眠质量减少后增加了炎症相关白细胞数量，从而增加动脉粥样硬化风险的途径[54]，同时，在共有靶点的KEGG 分析中也发现了动脉粥样硬化通路。细胞炎症的最终结果是凋亡，通过检测与凋亡相关的核心基因后发现，失眠小鼠脑组织中，AKT1、MAPK3、TP53 mRNA 表达量显著降低（P<0.001），经高剂量温胆汤治疗后表达量显著增加（P<0.001）；失眠小鼠脑组织中VEGFA、Caspase-3 mRNA 表达量显著增加（P<0.001），经高剂量温胆汤治疗后表达量显著降低（P<0.01），并且高剂量温胆汤调节mRNA 表达量能力强于阳性药物艾司唑仑片。本研究采用多种数据库进行分析，准确寻找温胆汤与失眠的共有靶点，并在共有靶点中构建网络分析核心靶点，在获取靶点信息的基础上加以实验验证，由于未使用所有的数据库，因此对于一些还未报道的靶点缺乏验证，今后将在获取温胆汤治疗失眠活性成分的基础上，以药物分子来验证失眠靶点。

综上所述，温胆汤治疗失眠的核心靶点是AKT1、MAPK3、TP53、VEGFA、Caspase-3、TNF mRNA。温胆汤通过核心靶点以及PI3K-AKT 信号通路、凋亡、p53信号通路调控脑组织细胞凋亡和存活，该研究为温胆汤或中药方剂治疗失眠提供了一定的方向。