张胤弢，刘心语，王玉玉，郭涛，张芳芳，邱继文，王玉明

（1.天津中医药大学研究生院，天津 301617；2.天津中医药大学中药学院，天津 301617；3.天津中医药大学针灸推拿学院，天津 301617）

脑卒中在中医中被称为中风，也被称为偏枯、偏风等，中医学认为“血瘀内阻，血行不畅，气机不通，故而百病丛生”。缺血性中风的病因以内因引发者居多，如情志郁怒引动内风而发卒中；或脾失健运，痰郁化热，虚阳化风扰动。病理变化为患者阴阳失调，内生风、痰、湿、火，以致气血运行受阻[1]。目前的一些研究表明部分中药可以改善缺血性脑卒中的微循环，减轻缺血再灌注损伤[2]，保护神经并且可以抑制细胞凋亡[3]。缺血性脑卒中的针刺治疗可能从增加脑血流量，增强脑组织抗氧化损伤能力，减轻脑组织炎症反应，调节神经递质的释放，调节星形胶质细胞激活等多个方面入手，从而促进神经功能的恢复[4]。

代谢组学可以识别特定生理和病理条件下的特异性分子标记物，并可用于研究代谢性疾病的发病机制和治疗药物的作用机制[5]。网络药理学可以通过分析靶点、通路等之间的关系，进一步揭示药物对于疾病的潜在治疗机制，在疾病、药物成分、潜在靶点、通路等信息之间构建出关联网络[6]。本文将尝试通过网络药理学和代谢组学，筛选针灸治疗的缺血性脑卒中相关潜在生物标志物及代谢通路，对针灸治疗缺血性脑卒中的潜在机制进行探索。

1 方法

1.1 活性成分及靶点的获取 在本次分析中，系统地在以下三个数据库中检索了相关术语：PubMed、CNKI 和万方数据库（时间：2012—2022 年）：中文检索式为（脑缺血OR 中风OR 脑卒中）AND（针灸OR电针OR 针刺）AND（抗氧化OR 炎症OR 神经生化OR 星形胶质细胞），英文检索词为（cerebral ischemia or stroke or stroke）AND （acupuncture or electroacupuncture or acupuncture）AND（antioxidant OR inflammation OR neurobiochemical OR astrocytes）。将英文活性化合物通过Swiss Target Prediction （http：//www.swisstargetprediction.ch/） 检索，以probability＞0 为标准，筛选出靶点或通过STITCH（http：//stitch.embl.de/）检索活性成分靶点，然后两者进行整合。

1.2 缺血性脑卒中相关疾病靶点的获取 以“Ischemic stroke”“cerebral ischemia”“stroke”为缺血性脑卒中的搜索词，利用Genecards 数据库（https：//www.genecards.org/） 得到缺血性脑卒中relevance score≥2 相关的疾病靶点。

1.3 成分-靶点网络构建 为进一步分析可视化研究结果，即直观展示针灸治疗缺血性脑卒中的潜在作用机制，利用Cytoscape 3.9.1 软件将得到的针灸的活性成分及联合治疗缺血性脑卒中的潜在靶点绘制成“治疗方式-成分-靶点”网络图[7]。

1.4 针灸治疗缺血性脑卒中的潜在靶点的取得及PPI 网络构建 将联合治疗的活性成分靶点定义为Therapy，缺血性脑卒中的疾病靶点定义为CIS，通过在线工具Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制出二者的Venny 图，点击交集部分得到潜在靶点。将潜在靶点输入String 11.5 数据库（https：//cn.string-db.org/），将物种设置为人，选择隐藏无互相作用关系的靶点，以minimum required interaction score＞0.4 作为筛选标准[7]，得到交集靶点的PPI 网络[8]。为分析靶点与蛋白之间的相互作用关系，将筛选后的数据选择TSV 格式下载并导入Cytoscape 3.9.1 软件，对交集靶点的PPI 网络进行可视化，根据度（degree）值大小筛选出核心靶点。

1.5 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析 为了挖掘针刺治疗对缺血性脑卒中的干预机制，将联合治疗与缺血性脑卒中交集靶点输入数据库David（https：//david.ncifcrf.gov/，version 2021），以P＜0.05进行基因本体（GO）注释及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。GO 功能富集分为生物过程BP（biological process）、细胞组分CC（cell components）和分子功能MF（molecular function）；KEGG 富集分析得到共有靶点富集的信号通路。下载各项数据表格，根据P 值大小再选择前10 条目通过在线分析工具微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）上选择“富集气泡图”进行可视化。

1.6 分子对接 通过PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库获取成分结构及核心蛋白质结构，运用Autodock 4.2 软件进行分子对接，PyMol 软件可视化显示。

1.7 材料与方法

1.7.1 实验动物 实验动物选择北京维通利华实验动物技术有限公司提供的健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠。大鼠称质量后分笼饲养1 周，饲养环境：通风良好，饲养温度25 ℃，相对湿度60%。笼中大鼠可自由摄取饲料和饮用水，饲料为维持性饲料。为帮助大鼠适应针刺干预，实验开始前3 d 对每只大鼠进行干预训练，把大鼠固定在自制鼠衣内半小时。适应性喂养1 周后，体质量控制在270～280 g，供后续实验使用。

1.7.2 试药与仪器 Waters Acquity UPLC 液相色谱仪，Waters Xevo G2 Q-TOF/MS 质谱仪，UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美国Waters 公司），G6805 型电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），一次性针灸针（苏州华佗牌，直径0.2 mm，针身长0.5 寸），线栓（北京西浓科技有限公司2036-A4）。

1.7.3 造模及分组 将大鼠随机分为3 组，分别是假手术组、模型组、巨刺组。采用Zea Longa 线栓法制作大鼠缺血性脑卒中模型，使用经异氟烷气体深度麻醉，术中小心分离大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉以及颈外动脉，使拴线从大鼠颈外动脉残端插入颈内动脉，直至距颈外动脉与颈内动脉分叉处1.8 cm处停止。线栓停留1.5 h 后拔除栓子，制备缺血再灌注损伤模型。假手术组大鼠仅分离上述血管，而不插入栓线。缺血1.5 h 后拔除线栓，将大鼠尾部提起，可见大鼠左侧前肢屈曲则视为造模成功[9]。

在适应性喂养一周的大鼠中筛选出24 只体质量在270～280 g 的健康雄性Sprague Dawley 大鼠，随机分为假手术组（Sham 组，简称S 组）、模型组（Model 组，简称M 组）、巨刺组（Model+Contralateral Acupuncture，简称MCA 组），每组8 只。

1.7.4 干预方法 1）针灸组：造模成功24 h 后，分别对MCA 组大鼠健侧肢体相关穴位进行电针干预，本实验中的中风选穴借鉴李忠仁先生著的《实验针灸学》经验，选取同侧上下肢体的内关、合谷、足三里、阳陵泉作为治疗穴位。在参考华兴邦《大鼠穴位图谱的研制》的取穴经验的基础上采用拟人比照法确定四穴位置。将穿上自制鼠衣的大鼠仰卧固定于实验台，针刺穴位常规消毒，针具选用中研太和牌（0.25×13 mm）规格毫针，MCA 组针刺大鼠健侧肢体合谷、内关、足三里、阳陵泉四个穴位，针刺后接电针，内关接正极，合谷接负极，上肢两穴形成一个电流环路；足三里接正极，阳陵泉接负极，下肢二穴形成一个电流环路。电针仪波形选择疏密波，10 Hz，2 强度，电针治疗过程中大鼠无痛苦叫声且肢体有轻微抖动。每次大鼠电针治疗30 min，每日1 次，持续14 d（1 d 先评分后针刺，4 d、7 d、14 d 先针刺后评分）。S 组与M 组大鼠每次仅进行30min 捆绑固定，不进行针刺。2）假手术组与模型组：抓取、固定方法同针灸组，但不进行针刺。

1.7.5 血液样品处理 将冻存于-80 ℃冰箱的血浆样品取出，4 ℃下解冻溶解。取100 μL 血清，加入300 μL 乙腈（1∶3 体积比），涡旋混匀1 min，冰水浴超声10 min，以13 000 r/min 的转速，4 ℃离心15 min，离心半径为6 cm，移取上清液200 μL 置进样小瓶中，待UPLC-Q-TOF/MS 液质分析[10]。

1.7.6 UPLC-Q-TOF/MS 数据分析 色谱条件Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温为4 ℃，进样量5 μL，流速为0.3 mL/min。流动相为0.1%甲酸水（A）和0.1%甲酸乙腈（B）。梯度洗脱条件：0～0.5 min，1% B；0.5～2 min，1%～50% B；2～9 min，50%～99% B；9～10 min，99% B；10～11 min，99%～1% B；11～14 min，1% B。

质谱条件电喷雾电离源（ESI 源），在正离子模式下进行分析，设置分子量扫描范围m/z 50～1 000；毛细管电压3.0 kV；干燥气温度325 ℃；干燥气体流速10 mL/min；离子源温度120 ℃；去簇电压为60 V/-60 V；碰撞能量为35/-35 eV。本实验运用Waters Acquity UPLC（Waters 公司，米尔福德，美国）进行代谢组学研究。采用电喷雾电离源（ESI 源），在正、负离子电离模式下进行质谱检测分析。毛细管电压：3.0 kV。干燥器温度：325 ℃。干燥气体流速：10mL/min。去溶剂流速：600 L/h。电离源温度：120 ℃。去溶剂温度：350 ℃。锥空气流速：50 L/h[10]。

1.7.7 数据处理 在Progenesis QI 软件建立新的实验对UPLC-Q-TOF/MS 采集的数据进行分组，VIP 值（VIP＞1）、t 检验（P＜0.05）是筛选出潜在生物标记物的两个受限条件，导入EZinfo 2.0 进行多元统计分析[11]。随后，使用生化数据库，包括HMDB（http：//www.hmdb.ca/）完成生物标记物的鉴定。Metaboanalyst（https：//www.metaboanalyst.ca/）用于代谢途径分析，进一步揭示缺血性脑卒中的发病机制。

1.7.8 统计学处理 所有统计方法均采用SPSS 24.0 软件，检验水平α＝0.05，当P＜0.05 时，表示具有统计学意义。

2 结果

2.1 针灸对缺血性脑卒中的治疗和疾病靶点的结果分析 对得到的文献进行分析获得谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Tyr）、多巴胺（DA）3 个针灸相关的活性成分；在Swiss Target Prediction 数据库和STITCH数据库获取靶点蛋白，共得到150 个靶点。

图1 文献筛选针灸活性成分流程图

在Gene Card 数据库得到1 475 个疾病靶点，对所得到靶点进行整理。

2.2 “治疗方法-活性成分-作用靶点”相关网络的构建 将针灸该种治疗方法在缺血性脑卒中作用的有效成分及相关靶点的network 文件和type 文件导入Cytoscape 3.9.1 软件，构建“治疗方法-活性成分-作用靶点”相关网络。

红色菱形部分为治疗方法，橙色矩形部分为各治疗方法对应的活性成分，绿色椭圆形部分为潜在治疗靶点。

2.3 针灸治疗在缺血性脑卒中的潜在作用靶点 将针灸的活性成分相关靶点进行合并去重，运用在线分析工具Venny 得到联合治疗对缺血性脑卒中疾病靶点、治疗靶点47 个（图3）。

图2 成分-靶点网络图

图3 活性成分-缺血性脑卒中潜在靶点韦恩图

2.4 联合治疗对缺血性脑卒中的治疗靶点网络分析 运用String 数据库（https：//cn.string-db.org）对联合治疗干预缺血性脑卒中的交集靶点进行PPI 分析，得到47 个节点，310 条边（图4）。在交集治疗靶点相互作用网络中，运用Cytoscape 分析得到连接度排名前10 的靶点分别为SLC6A3（溶质载体家族6），SLC6A4（溶质载体家族6），GRIN2B（N-甲基-D-天氡氨酸离子能谷氨酸受体2B），GRM2（谷氨酸的G 蛋白偶联受体），TH （酪氨酸羟化酶），GRM5（谷氨酸的G 蛋白偶联受体），DRD2 （多巴胺受体D2），COMT（儿茶酚-O-甲基转移酶），GRIN2A（N-甲基-D-天氡氨酸离子能谷氨酸受体2A），SLC6A2（溶质载体家族6）。

图4 活性成分-缺血性脑卒中潜在靶点互作网络

2.5 交集治疗基因靶点的GO 和KEGG 富集分析 为了挖掘联合治疗对缺血性脑卒中的干预机制，通过David 数据库进行GO 富集与KEGG 通路富集分析。GO 功能分析共富集到204 个生物过程（BP）、51 个细胞组分（CC）、60 个分子功能（MF）；KEGG 富集分析得到33 条通路。为了更直观地了解其基因功能和相关通路，以P 值作为参考进行排序，每一部分选取前10 位的条目，生成气泡图。横坐标为富集程度，纵坐标为前10 位条目。GO 富集分析得到针灸治疗干预缺血性脑卒中交集基因BP显著富集在化学突触传递，腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路，异种刺激响应，离子型谷氨酸受体信号通路，多巴胺代谢过程等生物过程（图5）。CC 主要富集在质膜的组成部分，突触后膜的重要组成部分，突触前膜的完整组成部分，谷氨酸能突触，突触后膜等部位（图5）；MF 主要在谷氨酸受体活性，离子型谷氨酸受体活性，多巴胺结合，肾上腺素结合等功能处富集（图5）。KEGG 中得到信号传导通路谷氨酸能突触、cAMP 信号通路、神经活性配体-受体相互作用等（图6）。

图5 针灸治疗缺血性脑卒中GO 功能分析

图6 针灸治疗缺血性脑卒中潜在靶点KEGG 通路富集分析

2.6 分子对接验证 分子对接构象的结合能越低，则结合构象越稳定，反映受体分子与配体之间结合的可能性越大。对接结果显示结合能均远小于-4 kcal/mol，结果显示靶点与活性成分之间可以稳定结合，分子对接结果结合能见表1。最后选取结合能＜-7 kcal/mol 的成分及靶点对接结果，示意图见图7。

图7 分子对接模式图

表1 分子对接结果

2.7 实验结果

2.7.1 模式识别分析 对各组大鼠血清代谢组学正离子模式下代谢物峰强度数据进行PCA 分析，显示巨刺组、模型组和假手术组大鼠之间在图中存在明显的分离趋势，证明各组间存在良好的组间差异[12]。分析结果表明，假手术组和模型组在正离子模式上具有显著差异，巨刺组与假手术组样本的空间距离比模型组更近，如图8。因此，推测巨刺组对缺血性脑卒中有一定的治疗作用，使缺血性脑卒中大鼠的代谢变化与正常大鼠相似。

图8 正离子模式下PCA 图

为了筛选可能导致假手术组和模型组、巨刺组和模型组之间具有显著差异的潜在生物标记物，分别建立了正离子模式下模型组和假手术组以及模型组和巨刺组的OPLS-DA 图和S-plot 图[13]。在OPLS-DA 中，对假手术和模型组的比较，对于正离子模式，R2Y（cum）=97%，Q2（cum）=79%；对于巨刺组和模型组的比较，对于正离子模式，R2Y（cum）=93%，Q2（cum）=83%；说明该统计模型具有良好的拟合性和预测能力，如图9。

图9 假手术组/巨刺组和模型组样本在正离子模式下的OPLS-DA 图和S-plot 图

2.7.2 血清差异代谢物筛选 采用VIP 值、FC 值和P 值等多项标准筛选出对假手术组和模型组分类贡献最大的内源性代谢物。通过多变量统计分析，将筛选出的潜在生物标记物重新引入到Progenesis QI 软件中进行进一步鉴定[14]。生物标记物是利用HMDB 数据库，通过化合物的实际和理论碎片离子来进行化合物鉴定。根据质量误差（ppm）、同位素丰度和碎片离子匹配度等，对化合物进行筛选，如表2。与假手术组相比，模型组大鼠大部分溶血磷脂酰胆碱（lysoPCs）的表达强度降低，脂肪酸水平呈上升趋势，而巨刺组组大鼠上述变化的代谢产物的含量部分恢复并接近假手术组水平[15]。

表2 潜在生物标志物汇总表

2.7.3 代谢通路分析 通过Metabo Analyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）对49 个差异代谢物进行通路分析，结果显示：上述代谢物参与甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、乙醚脂质代谢、赖氨酸降解、花生四烯酸代谢等代谢通路。将这些潜在生物标志物的名称导入Metabo Analyst 中，以进行途径富集分析[16]。代谢途径分析表明，如图10 和图11。这些代谢产物主要参与甘油磷脂代谢、亚油酸代谢等，结合网络药理学分析，突出了针灸影响作用的潜在治疗靶点。

图10 通路富集分析

图11 通路分析

3 讨论

谷氨酸不仅在人脑中担任着主要兴奋性神经递质的角色，更为关键的是其兴奋性毒性机制在缺血中可引起神经毒性，对脑缺血后的神经元会造成损害。星形胶质细胞是大脑中谷氨酸摄取的主要部位，对神经保护至关重要[17]。相关研究证实，在急性脑缺血超早期针刺可有效降低由于过度释放谷氨酸而导致的缺血缺氧，减少了对脑缺血的损害[18]。除此以外，在缺血再灌注损伤中，针刺还能提高GLT-1（大鼠谷氨酸转运体1）的表达，诱导早期脑缺血耐受性的建立[19]。酪氨酸会在体内产生的多种与神经传导调节控制关系密切的生理物质。在脑部，多巴胺主要参与精神情绪活动，保持神经兴奋性[20]。有实验研究证实针刺可以有效抑制多巴胺的释放，从而减轻对细胞和神经兴奋性产生的毒性反应影响[21]，进而可以保护缺血性脑卒中的受损脑组织。

PPI 网络构建，交集靶点中度中心性值排名靠前核心靶点有SLC6A3，SLC6A4，GRIN2B，GRM2，TH，GRM5，DRD2 等。SLC6A4 可以终止血清素的作用并以钠依赖性方式回收DAT（多巴胺转运蛋白）。GRIN2B 是NMDA 受体复合物的成分，具有高钙渗透性和对镁的电压依赖性、敏感性。作为中风损伤的中枢介质，它与突触外部位的DAPK1 配合，在Ser-1303 处发生DAPK1 磷酸化，增强了突触NMDA 受体通道活性，诱导有害的Ca2+内流，导致不可逆的神经元死亡。GRM5、GRM2，谷氨酸的G 蛋白偶联受体，在突触可塑性和神经网络活动的调节中起重要作用[22]。其配体结合会引起构象变化，通过鸟嘌呤核苷酸结合蛋白触发信号传导并调节下游效应子的活性。TH（酪氨酸羟化酶）参与酪氨酸向多巴胺的转化，是儿茶酚胺合成中的限速酶。

GO 富集分析发现，交集靶点主要富集在化学突触传递、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路等生物过程。KEGG 通路分析筛选得到相关信号通路有33 条，在前10 条通路中，涉及的信号传导通路有谷氨酸能突触、cAMP 信号通路、神经活性配体-受体相互作用等。cAMP 在中枢神经系统中是负责参与突触的传递的主力军，并且在轴突生长以及神经元的存活方面起到十分重要的调节作用。PKA 也可以积极调节神经元的存活、生长以及重塑突触，在这些方面也是起着举足轻重的作用[22]。且有研究证实cAMP/PKA-CREB 信号通路在调节神经元存活和轴突生长这两个方面起重要的作用，有可能是通过抑制RhoA 信号通路从而促进损伤轴突的再生[23]。此外，cAMP/PKA 通路会参与介导抗炎，以促进未分化的海马神经元轴突再生，且激活PKA 可以进一步激活p CREB 的构象变化，减弱髓鞘相关抑制因子在轴突再生方面产生的影响，从而满足促进轴突再生的目标[24]。因此，cAMP-PKA-p CREB 信号通路的激活促进损伤轴突的再生是恢复缺血性脑卒中的可能机制之一[25]。代谢组学KEGG 通路分析结果显示，主要代谢途径为甘油磷脂代谢、亚油酸代谢等，其中包含的代谢产物主要是磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱等。其中，胞二磷胆碱为磷脂酰胆碱合成的前体物质，而胞二磷胆碱可促进脂肪酸在细胞内的释放，抑制自由基的生成，从而改善脑缺血后的功能[26]。溶血磷脂酰胆碱在缺血性卒中的病理生理学中起着关键和枢纽作用，它与血小板活化、内皮细胞功能障碍、炎症E 细胞的活化和浸润、炎症细胞因子和黏附分子的表达、氧化应激、细胞的增殖和凋亡调节等事件紧密相关[27]。

4 结论

本文采用液质联用技术，基于血清代谢组学和网络药理学策略探究了针灸治疗缺血性脑卒中的作用机制[28-29]。结果表明大鼠缺血性脑卒中的形成主要与甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢乙醚脂质代谢、赖氨酸降解、花生四烯酸代谢的紊乱密切相关，针灸对缺血性脑卒中模型大鼠的治疗作用机制可能是通过影响SLC6A3，SLC6A4，GRIN2B，GRM2，TH，GRM5 等靶点对溶血磷脂酰胆碱（lysoPCs）和脂肪酸差异内源性代谢物的调节，使紊乱的代谢向正常状态转归，为深入的机制探讨提供一定的依据。