姚白雪,王 磊,唐泽文,徐宇璇,张丽楠,林乐清

(1.杭州师范大学 临床医学院,浙江 杭州 311121;2.杭州师范大学附属医院 重症医学科,浙江 杭州 310015)

脓毒症是重症监护室内主要的卫生健康问题,造成16%～33%的患者死亡[1]。脓毒症引起的心功能障碍称为脓毒症心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SICM),有报道表明50%的脓毒性休克患者存在心功能不全,死亡率高达70%[2]。SICM的发病机制尚未明确,近年来的研究表明外泌体在其中扮演着重要角色。本文对不同细胞来源的外泌体在脓毒症心肌病中作用机制的研究进展进行综述,以期为脓毒症心肌病的诊疗提供一些新的思路。

1 外泌体概述

外泌体是一种直径在40～160 nm(平均100 nm)的细胞外囊泡,包含核酸、脂类、代谢物、胞质和细胞表面蛋白质,介导体内不同类型细胞之间的信号通讯[3]。不同来源的外泌体及外泌体的不同内含物在脓毒症心肌病的病理生理机制中起着重要作用。研究表明脓毒症患者血浆外泌体水平与器官衰竭的严重程度及预测死亡率相关[4]。Pei等[5]发现间充质干细胞来源的外泌体在脓毒症小鼠模型中能减轻其心肌损伤。在这过程中发挥重要作用的是外泌体分泌的非编码RNA,包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)和长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)。此外,外泌体还与循环中的促炎因子、氧化物、内皮细胞功能障碍、钙调节等这些与脓毒症心肌病相关的因素也有着密切联系。其中,不同类型细胞来源的外泌体在脓毒症心肌病中发挥着不同的作用。

2 外泌体与SICM

2.1 内皮细胞来源的外泌体 内皮细胞的功能障碍被认为是脓毒症导致器官功能障碍的关键因素[6]。脓毒症发展过程中产生的病原体相关分子模式可激活内皮细胞,上调趋化因子和黏附分子的表达,从而促进免疫细胞浸润和炎症反应,导致器官损伤。热休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)主要表达于内皮细胞,对血管的生成起关键作用[7]。既往研究表明,HSPA12B在减轻内毒素诱导的心功能不全中起重要作用。最近,Tu等[8]通过动物实验明确了内皮细胞可以通过分泌外泌体来释放HSPA12B,进而下调巨噬细胞的促炎反应,起到对SICM的保护作用。与之相关的研究表明,血清外泌体可分泌以黏附分子为靶标的miRNA-126,HSPA12B通过调节miRNA-126的表达,从而减少免疫细胞在心肌中的积聚,进而减轻脓毒症所致的心功能障碍[9]。

此外,内皮细胞还可以通过旁分泌调节相邻细胞功能,而外泌体转运是旁分泌的重要途径之一。暴露于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的内皮细胞来源的外泌体可促进大鼠心肌细胞增殖,通过下调凋亡相关基因减轻心肌细胞凋亡,降低心肌细胞中乳酸脱氢酶和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,同时增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的水平。这提示了外泌体对心肌细胞的抗氧化应激的保护作用。在实验中,研究人员发现在高浓度(10 μg/mL)的LPS下,内皮细胞产生的微泡主要是凋亡小体,外泌体则明显减少。这说明内皮细胞产生的外泌体对心肌细胞的保护作用可能仅存在于脓毒症早期[10]。还有研究发现,脓毒症小鼠循环中的外泌体比正常小鼠循环中的外泌体含有更高水平的ROS,可以有效地转运到内皮细胞,导致内皮细胞骨架结构足体簇的生成。而足体簇促使细胞间连接的中央调节因子ZO-1的移位来破坏内皮细胞完整性,从而导致血管渗漏和心功能不全[11]。

2.2 血小板来源的外泌体 活性氧在各种心脏疾病的发病机制中起着重要作用,如心肌梗死和心力衰竭。体内活性氧和活性氮主要来源于产生超氧化物的还原型辅酶Ⅱ氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS),而血小板可以表达这两种酶,同时也具有相应的活性,而外泌体在这过程中发挥着重要的作用。脓毒症患者血小板来源的外泌体诱导产生NOX,通过活性氧依赖的途径诱导内皮细胞和血管平滑肌细胞凋亡[12]。在另一项研究中,脓毒症患者血小板分泌的外泌体含有NOS,诱导心肌细胞产生一氧化氮(NO),促进活性氧/活性氮的产生,导致内皮细胞的凋亡;同时外泌体可导致暴露于内毒素的离体动物心肌收缩力下降,且这种改变在外泌体退出时是完全可逆的[13]。

NOS是一种能结合钙调蛋白且含有血红素的酶,其中诱导型NOS在细胞内几乎不表达,但可以被LPS、细胞因子等诱导表达产生过量的NO,在脓毒症发展的过程中造成组织的损伤。NO是一种在心血管病理生理中起核心作用的信号分子,通过调节冠状动脉张力、血栓形成、炎症、兴奋-收缩偶联等影响心脏功能。其中NO与超氧化物结合可导致过氧亚硝酸盐的产生,这种化合物被认为是心肌抑制的主要因素,且可以引起包括蛋白质、脂质和DNA在内的生物分子的氧化损伤。有研究将脓毒患者循环中的外泌体静脉注入小鼠体内,观察到小鼠心脏中的NO、前列腺素、诱导型NOS表达增强,而这些效应与促炎反应和氧化应激相关[14]。

中性粒细胞在脓毒症的免疫反应中起着重要的作用,除了吞噬功能,中性粒细胞还可以释放中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps ,NETs)来捕杀微生物。但过度的NETs形成可能导致脓毒症中多器官功能障碍的发生,而血小板可能参与了脓毒症中NETs形成的这一过程[15]。有研究证明了血小板来源的外泌体通过分泌高迁移率族蛋白1(high mobility group protein,HMGB1)和/或miRNA-15b-5p和miRNA-378a-3p诱导中性粒细胞内自噬通路激活和NETs的形成;同时也发现抑制血小板来源外泌体的分泌能减轻脓毒症相关的肺损伤[16]。结合上述研究,血小板分泌的外泌体可能通过表达NOS、NOX和形成NETs这些途径参与SICM的发展过程中。

2.3 巨噬细胞来源的外泌体 目前SICM的潜在机制仍不明确,但已明确的是脓毒症引起的多器官功能衰竭是由于持续的促炎细胞因子风暴。脓毒症中外泌体的促炎作用包括诱导巨噬细胞极化,增强其促炎因子的分泌,诱导幼稚T细胞分化辅助T细胞及刺激白细胞趋化。循环中过量的促炎因子被认为是心肌抑制物质,而外泌体被认为是这些细胞因子的载体[17]。其中细胞因子主要通过巨噬细胞及其他免疫细胞激活Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs),而Toll样受体在诱导先天免疫和炎症反应中起关键作用。它通过识别病原体相关分子模式,将信号转导到细胞,主要激活核转录因子-kB,控制促炎因子的表达,在介导脓毒症所致的心功能不全中起重要作用[18]。既往研究表明,从分枝杆菌感染的巨噬细胞中分离出的外泌体可以诱导促炎反应,而LPS处理后的巨噬细胞缺陷的小鼠能部分恢复心肌细胞缩短[19]。为进一步探究巨噬细胞来源的外泌体与脓毒症引起的心功能不全的关系,Essandoh等[20]用大肠杆菌LPS处理巨噬细胞并分离外泌体,发现外泌体含量明显增加,且促炎因子水平升高。用GW4869(一种中性鞘磷脂酶抑制剂,目前应用最广泛的阻断外泌体生成的药物)抑制LPS处理的巨噬细胞外泌体的产生,能减少促炎细胞因子的产生;同时能在小鼠模型中抑制LPS引起的中性粒细胞的心肌浸润,减轻心功能障碍,降低死亡率。这证实了阻断巨噬细胞来源的外泌体的释放,可以减少循环中促炎细胞因子水平,减轻脓毒症所致的心功能障碍和死亡率[20]。

高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种核蛋白,在细胞内调节基因表达和染色质结构。HMGB1一旦释放到细胞外,可被巨噬细胞激活,以调节炎症反应。循环中HMGB1水平升高与脓毒症的严重程度呈正相关。Yang等[21]研究表明,乳酸促进了HMGB1的乳糖化、乙酰化,并通过巨噬细胞外泌体分泌促进HMGB1的释放。而含有HMGB1的外泌体进一步破坏内皮黏附和紧密连接蛋白,增加黏附分子表达,导致内皮屏障功能障碍。结合HMGB1在心脏炎症损伤和再生重塑中的作用[22],这种核蛋白可能在脓毒症患者出现心功能不全中发挥一定的作用。事实上,已有研究表明,miRNA-181b过表达可下调脓毒症大鼠HMGB1的表达,从而减少炎症因子和心肌损伤,抑制心肌细胞凋亡[23];lncRNA PVT1通过miRNA-29a/HMGB1轴促进M1巨噬细胞极化,加重LPS诱导的心肌损伤[24]。

2.4 间充质干细胞来源的外泌体 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)来源于骨髓或脂肪组织,在适当环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,具有多种生物学功能,如促进损伤组织再生、调节免疫反应等。以往研究表明,MSCs在LPS诱导的脓毒症模型中能有效降低死亡率和改善心肌功能,且在注射MSCs 5～10 min后发现其主要分布在肺和肝脏中,在心脏组织检测不到[25-26]。因此考虑MSCs诱导的心肌保护作用可能与局部作用无关,与旁分泌所致的全身效应相关。而外泌体是MSCs旁分泌的关键效应因子,从MSCs释放的外泌体(MSC-exos)能通过调节miRNA-182的表达来减轻动物模型的心肌缺血再灌注损伤[27]。为明确MSC-exos是否与脓毒症中心肌保护相关,Wang等[28]将缺少miR-223的MSC-exos注射到脓毒症小鼠体内,发现其并未改善心功能和存活率,而miR-223是一种在高度富集于MSC-exos中的microRNA,进而表明MSCs对脓毒症心脏的保护作用可能依赖于外泌体中miR-223的表达。此外,Liu等[29]的研究在证明MSC-exos对体外炎症模型心肌细胞和体内脓毒症模型心肌细胞均有保护作用的同时,还发现通过调控MSC-exos的潜在基因miR-146a-5p过表达可促进LPS诱导的心肌细胞增殖,抑制其凋亡。

除了通过调节microRNA外,MSC-exos还可能通过降低钙超载来减少线粒体损伤进而保护脓毒症时的心功能。钙是体内重要的第二信使,在心肌收缩力中起关键作用。线粒体主要通过钙摄取——由呼吸链产生的质子泵通过内膜产生的相当大的电压驱动以及由线粒体Na+/Ca2+交换器介导的线粒体Ca2+外流[30]来调节钙。脓毒症早期心肌细胞线粒体钙摄取无明显变化,但钙外流明显异常,这表明SICM是与线粒体钙外流减少所致的线粒体钙超载相关[31]。有研究证实了MSC-exos会被盲肠结扎穿孔诱导的脓毒症小鼠心肌细胞摄取,同时观察到被外泌体处理后的心肌细胞中仅表现为少数线粒体嵴数量减少,并能逆转心肌细胞钙外流的减少,这表明了外泌体的线粒体保护作用。目前越来越多的证据表明,间充质干细胞来源的外泌体可以改善心脏功能,促进心脏再生和修复[32],对未来脓毒症心肌病的治疗具有指导意义。

3 结语

综上所述,目前对脓毒症患者如何导致心功能不全仍缺乏完整的了解,但其中外泌体在脓毒症心肌病中的作用机制可包括:内皮细胞来源的外泌体通过释放HSPA12B减轻促炎反应、降低ROS水平保护心肌细胞;血小板来源的外泌体可诱导心肌细胞中NO的产生,导致细胞凋亡和功能障碍,从而导致心肌病,且也可能通过形成NETs这一途径参与脓毒症心肌病的发展过程中;巨噬细胞来源的外泌体可增加循环中细胞因子水平,促进中性粒细胞的心肌浸润及内皮屏障功能障碍,进而导致脓毒症的心功能障碍;间充质干细胞来源的外泌体通过释放miR-223及降低钙超载来保护心肌细胞,抑制其凋亡,可作为未来一种保护心肌的手段。此外,外泌体分泌的miRNAs和lncRNAs通过参与炎症信号通路、调节炎症因子、调控心肌纤维化及内皮细胞功能等途径也在脓毒症心肌病中发挥着重要的作用。近年来,越来越多的研究聚焦于脓毒症及外泌体的联系上,这些新的发现可能会对脓毒症心肌病的早期识别、早期诊断及治疗提供临床意义。