宋功吉, 王煜煜, 王善龙, 王建南,2, 许建梅,2

(1. 苏州大学 纺织与服装工程学院, 江苏 苏州 215021; 2. 苏州大学 纺织行业医疗健康用蚕丝制品重点实验室, 江苏 苏州 215127)

由意外和创伤造成的周围神经损伤会导致中枢神经与周围器官之间的感知神经和运动神经异常,甚至会导致自主神经功能的部分或全部丧失,这将会对患者的日常生活造成极大不便[1]。虽然目前可通过自体神经移植手术进行治疗,但这种方法的成功率较低,且存在供体神经源有限、供区神经与受损神经匹配度差、手术时间长和需要多次手术等缺陷[2],因此,急需研发新的神经替代物来提高周围神经损伤修复的效果。人工神经导管可作为一种替代自体神经移植的理想方案,其管状结构能够连接被切断的神经,并作为引导轴突生长的通道,进而促进受损神经的再生[3]。目前,采用编织法、静电纺丝等纺织加工方法制备的神经导管,融合了纺织、医学、生物等多学科技术[4],在导管力学性能以及高聚物材料使用方面都具有明显的优势。

高聚物因其优异的可加工性、生物相容性和降解性,被广泛应用于神经组织工程,常用的高聚物包括:丝素蛋白、胶原蛋白、壳聚糖等天然高聚物;聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯醇(PVA)和聚己内酯(PCL)等合成高聚物。研究表明,电刺激既能促进轴突的再生,也能为自然细胞的分化提供信号[5],但高聚物通常都是非导电材料,无法产生电刺激响应,因此,可通过表面涂覆或在高聚物中加入导电性物质如碳纳米管(CNT)、聚吡咯(PPy)、聚苯胺(PANI)等制备导电性人工神经导管。其中,CNT因其独特的化学、力学、结构、导电特性以及可改性,在神经组织的修复与再生中备受关注;并且CNT特有的纳米形貌更有利于神经细胞的黏附,刺激细胞进行相关基因、生物信号的表达,从而促进细胞增殖与轴突再生;CNT具有一定的细胞毒性与基因毒性,经过功能化处理后,CNT的细胞毒性可明显降低,因而需要不断探索复合工艺使CNT与高聚物基体材料结合的稳定性提高,降低其与细胞接触时的毒性[6]。

本文探讨了碳纳米管的性能,包括微观形貌、电学性能和生物相容性等,以及其对神经再生的影响与作用机制;分析碳纳米管的功能化改性及其对神经再生的促进机制;高聚物和碳纳米管复合制备导电性人工神经导管的方法,以及高聚物与碳纳米管复合导电性人工神经导管的再生效果,为导电性人工神经导管的研究和发展提供参考。

1 碳纳米管的性能与神经再生

神经再生是指退化了的神经和神经组织的再生、恢复或修复,其与轴突、神经元和突触等的重新产生有关[7]。神经损伤后,植入人工神经导管为神经组织的再生提供了物理引导[8],而具有导电性的导管更有利于神经再生。碳纳米管是具有无缝中空圆柱结构的一维纳米级材料,其性能优异,具有尺寸小、比表面积大、长径比大等特点,还具备非常高的强度和韧性,以及优异的导电性能[9]。高聚物与碳纳米管的复合不仅使神经导管具备导电性,且碳纳米管的纳米形貌和功能化改性,使其在神经修复中发挥着非常好的作用。

1.1 碳纳米管的纳米形貌

碳纳米管的形态结构与神经突起很相似,小的碳纳米管束的尺寸也与树突相似,且碳纳米管具有巨大的电化学接触表面积,可使其与细胞或组织之间的相互作用界面达到最大[10]。高聚物基底上的碳纳米管加强了界面处的神经信号传递[11],为神经元的存活、分化、生长提供了一个有利的环境[12]。

纳米材料的纳米形貌表面能构建出类似于细胞外基质的微环境,并能在纳米尺度上与神经元膜相互作用[13]。碳纳米管界面能为神经元的黏附提供一种纳米级的结构引导[6],神经胶质细胞附着在碳纳米管上时,也可分泌出一些促进神经元与碳纳米管黏附的蛋白质(如纤连蛋白),且当碳纳米管的表面粗糙度与神经元突起的长度尺度相适应时,更有利于细胞的黏附[14]。

1.2 碳纳米管的电学特性

高聚物掺杂碳纳米管改善了神经导管的电传导性能。纯化的碳纳米管是神经元良好的生长界面,碳纳米管与神经元之间的电耦合也能促进神经信号传输效率的增加[15],这是因为碳纳米管作为一维导电材料,其各向异性的导电性与神经元的导电性有一定的相似之处,有利于中枢(大脑、脊髓)或周围神经系统中神经网络信号的传导[10]。利用碳纳米管的导电特性,配合外部电刺激作用,可更好地促进神经功能的恢复[16]。研究发现:用20 Hz的电刺激1 h,可上调生长因子的表达,能够增强和加速神经损伤后的功能恢复[17]。因为神经细胞具有内在的电活性,所以高聚物复合碳纳米管制备的导电神经支架为其提供了施加电刺激的媒介,进而能够促进神经突起的生长和活体功能的恢复[16]。

Malarkey等[18]还发现,只有在一定电导率范围内的碳纳米管才能促进神经突的生长,其制备了碳纳米管和聚乙二醇接枝共聚物,然后喷涂到热玻璃片上以形成均匀的导电薄膜,通过调整薄膜厚度分别制备了电导率为0.3、28、42 S/cm的导电膜。在其上进行神经元细胞体外培养发现,电导率为0.3 S/cm时,神经元的分枝与轴突生长的长度均为最优,而更高的电导率水平反而可能会损害细胞的活力。

1.3 碳纳米管的生物相容性

生物相容性是指生物材料在宿主的特定环境和部位,与宿主直接或间接接触时所产生相互反应的能力,是材料在生物体内处于动态变化过程中,能耐受宿主各系统作用而保持相对稳定、不被排斥和破坏的生物学特性。

碳纳米管通常与神经元组织表现出较好的相容性。Mattson等[19]在关于碳纳米管生物相容性体外研究的首次报道中指出:当神经元在碳纳米管上培养8 d后,仍旧存活并继续生长,表明碳纳米管能支持细胞的长期存活,并允许轴突的生长。当通过共价或非共价的方法将CNT牢固固定在高聚物表面上时,CNT不会在体内四处游离而集聚在组织中导致炎症等不良反应[7]。此外,通过在碳纳米管基体材料上形成纳米图案化表面,还可以提高细胞的黏附增殖,引导轴突的生长方向[20]。

经过纯化或功能化等方法处理的碳纳米管的溶解性提高,且不易集聚,不会对细胞膜造成严重的损伤,不会破坏细胞的完整性[21]。Zhao等[22]发现多壁碳纳米管氮功能化后具有较低的溶血率,能够抑制血小板的黏附和血栓的形成,且细胞黏附强度和细胞存活率较高。多项研究[23-24]表明,经过表面功能化改性,碳纳米管可获得较低的毒性和非免疫原性,但碳纳米管的加入也一定程度上减缓了高聚物在体内的降解速度[25]。

2 碳纳米管的表面改性

碳纳米管在生物体内应用时,面临的最大问题是其潜在的生物毒性与基因毒性。CNT与生物体作用时,通过胞吞进入细胞体内而可能产生潜在的生物毒性,提高细胞内化作用可以显著降低生物毒性。而CNT的长径比、聚集度、表面化学基团都是细胞内化作用的重要影响因素。未经处理的CNT不具有水溶性、易团聚,即使剂量很低,也可因为团聚而不是在纳米尺度上与细胞作用,从而降低细胞内化作用,影响高聚物/CNT复合导管在细胞体内的降解、代谢等[26],因此,需对CNT进行表面功能化处理来改善其水溶性[27],处理过程见图1。

图1 碳纳米管的表面功能化

CNT的表面功能化改性有多种方法,最简单的方法是用带正电荷或负电荷的化学物质通过共价结合的方法修饰碳纳米管,如引入带正电荷的氨基或带负电荷的羧基和巯基等[26]。Hu等[28]用带负电荷的羧基、中性的聚间氨基苯磺酸和带正电荷的乙二胺,对多壁碳纳米管进行功能化改性,结果发现带正电荷的碳纳米管底物上生长的神经元轴突的平均长度明显更高,这也证明了可以通过化学修饰碳纳米管的方法控制神经突的延伸和分支。

碳纳米管的表面功能化改性也可通过非共价结合的方式,使用聚合物、表面活性剂包裹碳纳米管,改变其表面疏水性,改善其生物相容性,增强与细胞的相互作用。常用的聚合物主要为亲水性的聚乙二醇(PEG)、聚乙二胺(PEI)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)等。Heister等[29]将碳纳米管聚乙二醇化后进行细胞实验发现,细胞的存活率显著提高,聚乙二醇化一方面增强了碳纳米管分散稳定性,另一方面也减少了细胞非特异性摄取的能力。动物实验中,有研究[30]直接将聚乙二醇化的水溶性碳纳米管注射到大鼠体内脊髓损伤处,几周后观察到损伤部位的神经丝和皮质脊髓束纤维增加。

除以上简单的表面功能化改性外,还可进行生物功能化改性。一些生物因子[31]如药物、生长因子、黏附蛋白、基因等,均能够用来特异性修饰碳纳米管,这不仅能降低其细胞毒性,更能促进细胞黏附、轴突生长、神经元分化以及神经组织的再生。

3 高聚物/CNT复合神经导管的制备

复合CNT的导电性人工神经导管主要是通过将碳纳米管与高聚物共混或交联等,再利用3D打印[32]、静电纺丝[33]和溶液浇铸[34]等技术进行制备。图2示出导电性神经导管支架制备方法。表1列出不同高聚物和碳纳米管复合制备的导电性神经导管的性能以及体内外应用效果。

注:BAPO—苯基双 (2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦;PGF—磷酸盐玻璃微纤维。

3.1 3D打印技术

使用3D打印技术制备导电性人工神经导管,通常将碳纳米管和高聚物溶解共混,调配出可以用于打印的生物油墨,然后利用CAD等辅助软件进行结构设计。Lee等[35]通过3D打印技术成功制备出一种复合神经支架(制备过程见图2(a)),其将功能化的多壁碳纳米管(MWCNTs)和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)共混搅拌制备成生物墨水,然后打印出分散性良好且具有可调多孔结构的神经支架。细胞实验发现该导电性支架能够有效地促进神经突起的生长。

3.2 静电纺丝

使用静电纺丝技术制备导电性人工神经导管,通常在配制纺丝液时,将碳纳米管均匀分散到高聚物中进行纺丝。Yu等[25]先将胶原蛋白和聚己内酯(PCL)按1∶1的质量比混合溶解,再加入多壁碳纳米管制备成纺丝液(制备过程见图2(b))。该导电性人工神经导管呈黑色,能够与神经残端组织很好地融合。碳纳米管的加入改善了复合支架的力学性能,一定程度上加速了神经的再生,但也明显减缓了神经支架的降解速度。

3.3 其它制备方式

将碳纳米管与高聚物混合后还可通过溶液浇铸、浸提或涂覆等方法制成导电性神经导管。Zang等[37]将多壁碳纳米管分散在明胶溶液中,然后涂覆在聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)基底表面上(见图2(c)),制备了一种纳米微孔支架。Mottaghitalab等[23]使用冷冻干燥和静电纺丝联合的方法制备了神经引导导管,首先通过冷冻干燥法构建丝素/单壁碳纳米管(SF/SWCNT)基底,然后在其表面静电纺取向的纤维连接蛋白纳米纤维(FN),最后卷曲成神经导管(见图2(d))[40]。溶液浇铸法是将碳纳米管和高聚物的混合溶液注入到设计好的模具中,然后让其固化成型[34],因此也称模具法。溶液浇铸固化通常可采用冷冻干燥或光交联固化等方法。Zhou等[36]将碳纳米管和聚己内酯富马酸酯(PCLF)混合溶液注入到玻璃模具中,并采用紫外线诱导的光交联技术交联聚合物(见图2(e))。

4 高聚物/CNT复合神经导管的应用

高聚物/CNT复合神经导管具有较好的电学性能,有利于神经信号的传递,支持树突延长和细胞黏附[41],能够支持、促进和引导缺损的轴突末端的再生。由表1可以看到,复合碳纳米管的神经导管材料具有较好的生物相容性,可以明显促进雪旺细胞、PC12细胞、神经干细胞等细胞的黏附、生长、增殖。从表1的动物实验可以看到,一般在12～16周神经再生基本完成,其功能基本得到恢复,导电复合神经导管在大鼠坐骨神经、背部神经等神经的损伤修复中表现出较好的神经再生效果。合适的电导率在神经再生修复过程中可以支持受损神经的电传递,促进神经元和轴突的生长,加快再生神经纤维的髓鞘化与功能恢复,从而促进神经肌肉再生[38],缩短神经再生修复的周期[18,23]。一般电导率在10-4～10-3S/m时,神经修复效果较好,过高的电导率反而会影响细胞活力,影响神经再生效果。

5 结束语

碳纳米管的高强度、低质量、高导电性和生物相容性使其在生物传感器[42-43]、生物电极[44]、生物显像剂[28-29]、抗菌[45]和药物输送[46-47]等领域都有着重要的应用,特别是近年来碳纳米管在人工神经导管中的应用渐成热点。将高聚物和碳纳米管复合材料用于周围神经损伤修复的人工神经导管的研究中,应特别关注以下几点。

1)碳纳米管在神经修复中的突出作用:一是由于其特有的纳米形貌有利于与神经细胞膜在纳米尺度上作用,创造类细胞外基质环境,从而促进神经元黏附生长,因此,将碳纳米管与高分子材料复合时应注意保留复合材料基质的纳米形貌;二是碳纳米管优异的电学性能可以促进轴突生长,且与电刺激协同作用可最大程度地发挥碳纳米管在神经再生修复中的作用。

2)碳纳米管虽然生物相容性较好,但是应用于生物体内时其细胞毒性与基因毒性仍然受到质疑,对碳纳米管表面进行各种功能化改性不仅可改善其水溶性,提高可加工性,其细胞相容性也大大提高,且体内实验也证实功能化的碳纳米管可以更好地促进损伤神经的再生和修复。

3)将碳纳米管与不同高聚物共混、交联,采用不同方法可制备出不同结构的人工神经导管,应特别关注碳纳米管的添加量以及神经导管的降解速度,以确保不会因降解产物短时间过量而引起代谢毒性。