侯颖 徐福强 李艳梅 刘青

世界范围内宫颈癌为女性死亡率前五的疾病，近年来我国宫颈癌患者的发病人群逐渐趋于年轻化，且发病率逐年升高［1］。既往研究中发现宫颈癌的发生与HPV 感染、过早性生活、多个性伴侣等均有密切相关性，且宫颈癌的发生需要经过宫颈病变逐级递增的过程［2］。但是目前临床中已有的检测和筛查对于宫颈病变的使用仅限于细胞学和病毒层面，检测的深度和范围均不够，对于患者的预后预测准确性不足［3-4］。因此有学者提出［5］，寻找既能够预测宫颈病变进展趋势，也能够预测宫颈癌患者预后的分子标记物，对于临床诊治宫颈疾病有重要意义。细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）是细胞骨架中的一种中间丝蛋白，在应激状态、上皮细胞向恶性肿瘤转化、细胞凋亡耐受等方面发挥着重要作用［6］。既往研究指出，p16 基因作为细胞周期中的重要基因，是可抑制细胞分裂的抑癌基因，其在多种肿瘤的发生中均有一定的作用［7］。因此本文分析了CK10、p16 蛋白在早期宫颈癌组织中的表达及其与预后关系，以期能为后期临床治疗提供指导。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取首都医科大学附属北京佑安医院2015 年1 月至2017 年1 月采集的宫颈石蜡标本共200 例，其中正常宫颈组织50 例（来源于健康者）（A 组），低级宫颈鳞状上皮内病变50 例（B 组），高级宫颈鳞状上皮50 例（C 组），早期宫颈癌50 例（D 组）。200 例患者平均年龄为（43.29±4.43）岁。平均肿瘤直径（2.56±0.73）cm。纳入标准：①初发宫颈癌的患者；②年龄≥18 周岁的患者；③入组前未行任何放化疗治疗或药物治疗的患者；④术后顺利完成5 年随访的患者；⑤各项临床资料和随访资料均完整的患者。排除标准：①存在子宫先天畸形、宫颈癌病史的患者；②合并其他部位恶性肿瘤的患者；③年龄＞70 周岁的患者；④因其他非本研究疾病因素死亡的患者。研究经院伦理委员会批准同意，患者均知情同意。

1.2 主要仪器及试剂

①仪器：半自动免疫组化仪（BenchMark XT；中国罗氏）；HM325 切片机（美国THERMO Fisher）；光学显微镜（日本Olympus）；DML2000 基因杂交信号扩大仪（德国DIGENE）；电热恒温水温箱（中国新苗医疗）；振荡器（中国风沙渡）；②试剂：鼠抗人CK10 及p16 单克隆抗体（北京中杉金桥生物有限公司）；脱蜡清洗液、苏木素染色液、二氨基联苯胺显色剂、柠檬酸钠清洗缓冲液、细胞前处理清洗缓冲液、封盖清洗缓冲液（美国罗氏）；Biosharp RIPA 裂解液（北京兰杰柯科技有限公司）。

1.3 免疫组织化学染色法

各组蜡块标本均二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，微波修复抗原，加蒸馏水冲洗，加鼠抗人CK10 单克隆抗体或鼠抗人p16 单克隆抗体、存活蛋白单克隆抗体，置于4℃的环境内孵育12 h，使用磷酸盐缓冲液进行3 次冲洗，5 min/次，加50 μL 二抗（羊抗鼠抗体），置于25℃的环境内孵育0.5 h，使用磷酸盐缓冲液进行3 次冲洗，滴加二氨基联苯胺显色剂，显色5 min，使用自来水冲洗，并使用磷酸盐缓冲液进行3 次冲洗，2 min/次。使用苏木素复染2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，使用中性树胶封片，置于BX41 高倍镜下观察并拍摄。已知免疫组化染色阳性一抗作阳性对照，以磷酸盐缓冲液作为阴性对照，判定CK10 及p16 蛋白情况。

1.4 CK10 及p16 蛋白阳性判定

结果均由两位医师采用双盲法判定，随机选取5 个高倍镜视野，每个视野计数200 个细胞，阳性细胞表现为黄色/棕黄色颗粒，观察CK10 及p16阳性细胞所占细胞总数的百分比。阴性为＜25%、＞25%为阳性［8］。

1.5 临床特征

对CK10及p16蛋白阳性表达患者的临床特征进行比较，包括年龄、肿瘤直径、病理类型、宫颈癌分期、分化程度、淋巴结转移、浸润间质深度、脉管癌栓。

1.6 预后

分别随访CK10、p16 蛋白阳性和阴性患者术后5 年的生存情况。

1.7 统计学方法

采用SPSS 24.0软件对数据进行统计分析。计数资料以n（%）表示，行χ2检验。等级比较为秩和检验，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Log-rank检验生存情况。以P＜0.05为差异统计学有意义。

2 结果

2.1 CK10 蛋白的表达

CKl0 阳性表达定位于细胞质，为黄色/棕黄色颗粒。见图1。CK10 蛋白在A、B、C、D 组的阳性率分别为80.00%、66.00%、34.00%和22.00%，在早期宫颈癌中的阳性表达率最低，其次是宫颈病变，且随着病情的加重而降低。见表1。

图1 CKl0 蛋白的表达（免疫荧光法，×100）Figure 1 Expression of CKl0 protein（Immunofluorescence，×100）

表1 各组CK10 蛋白的表达［n（%）］Table 1 Expression of CK10 protein in each group［n（%）］

2.2 p16 蛋白的表达

p16 阳性蛋白表达定位于细胞核和细胞质，呈棕黄色颗粒状沉积。见图2。p16 蛋白在A、B、C、D 组的阳性率分别为10.00%、36.00%、64.00%和90.00%，在早期宫颈癌中阳性率最高，其次为宫颈病变，且随着病情的加重而增高。见表2。

图2 p16 蛋白表达（免疫荧光法，×400）Figure 2 p16 Protein Expression（Immunofluorescence，×400）

表2 p16 蛋白表达［n（%）］Table 2 p16 protein expression［n（%）］

2.3 CK10 表达与早期宫颈癌的临床特征

A 组中CK10 阳性表达40 例，其中肿瘤中高分化、无淋巴结转移、浅层浸润间质的早期宫颈癌患者CK10 蛋白阳性率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 CK10 表达与早期宫颈癌的临床特征［n（%）］Table 3 CK10 expression and clinical characteristics of early cervical cancer［n（%）］

2.4 p16 表达与早期宫颈癌的临床特征

肿瘤低分化、有淋巴结转移的早期宫颈癌患者p16 蛋白阳性率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 p16 表达与早期宫颈癌的临床特征［n（%）］Table 4 p16 expression and clinical characteristics of early cervical cancer［n（%）］

2.5 预后情况比较

随访5 年内，2 例CK10 蛋白阴性表达患者因肿瘤复发死亡，阳性表达无一例死亡；5 例p16 蛋白阴性表达患者无一例死亡，2 例p16 蛋白阳性表达患者因肿瘤复发或转移死亡。CK10 蛋白阳性及p16蛋白阴性表达患者的预后较佳。见表5、图3。

图3 CK10、p16 表达与早期宫颈癌患者的生存关系Figure 3 The relationship between CK10、p16expression and the survival of patients with early cervical cancer

表5 预后情况比较［n（%）］Table 5 Comparison of prognosis［n（%）］

3 讨论

既往研究中已指出［9］，正常的宫颈组织进展为宫颈癌需要8～12 年的时间。因此应注意做好早期筛查，并对确诊患者及时实施针对性治疗，以提高临床治愈率、改善预后。但部分患者的肿瘤分期较早，经根治性手术及放化疗治疗后，其预后仍较差。因此，临床中需要寻找可提示疾病预后的生物学标志物及免疫抑制检查点，以便改善预后［10-11］。

正常宫颈组织内CK 蛋白的表达具有一定的选择性，且其在正常宫颈组织转向癌前病变或浸润性肿瘤时会有一定的规律性变化，因此可作为评估和预测宫颈病变的标志物。本文结果显示提示CK10 表达缺失可能是表皮细胞转化为恶性的标志之一，猜测可能是由于HPV 感染转化为宫颈癌的过程中，PI 3 激酶信号抑制，上皮组织发育受损，因此CK10 水平降低。

p16 为细胞周期的调控蛋白，既往研究中也指出p16 蛋白在膀胱癌、肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的发生、进展过程中均有作用［12］。本文结果显示，p16 蛋白在早期宫颈癌中阳性率最高，其次为宫颈病变，且随着病情的加重而增高。p16 蛋白能与细胞周期依赖性激酶结合，调节细胞周期，抑制恶性细胞的增殖和分化，预防恶性肿瘤的发生。当p16 基因失活时，其蛋白表达活性降低，因此细胞周期紊乱，细胞癌变率升高。既往研究中发现［13］，p16 蛋白在宫颈鳞状上皮癌前病变、宫颈癌组织、宫颈柱状上皮癌前病变中均有广泛表达，因此p16 蛋白对宫颈癌前病变的诊断具有一定的作用。研究早期宫颈癌患者CK10、p16 蛋白阳性表达的预后，发现CK10 蛋白阳性及p16 蛋白的阴性的患者预后较佳，提示监测CK10 和p16 的阳性表达可预测早期宫颈癌患者的预后。既往研究中指出p16 蛋白表达与宫颈癌患者的年龄相关，年龄越大，p16 蛋白阳性表达率越高［14］，本研究未进行相关分析，进一步的结果还有待今后予以分析研究。综上所述，CK10、p16 的表达水平与宫颈病变程度相关，肿瘤中高分化、无淋巴结转移、浅层浸润间质的早期宫颈癌患者CK10 蛋白阳性率较高，预后较佳；肿瘤低分化、有淋巴结转移的早期宫颈癌患者p16 蛋白阳性率较高，预后较差。