李瑞超 贾莉 吴立丽 郭玮 宫艳美 张俊萍

肺癌是临床发病率较高的恶性肿瘤，患者转归与肿瘤临床分期、是否发生转移等有关［1-2］。有研究表明，沉默原癌基因（B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration site 1，Bmi-1）表达紊乱会表现出多方面的促癌变行为，核蛋白Bmi-1可抑制机体细胞正常凋亡，并促进机体细胞增殖，导致癌变［3］。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3）是一种蛋白酶，可切割靶蛋白分子天冬氨酸上残基的肽键，从而造成细胞凋亡［4］。有研究表明［5］Bmi-1 和Caspase-3 的表达与多种肿瘤的发生具有相关性，但其与肺癌是否相关的研究较少。RNA 聚合酶延长相关因子-2（RNA polymeraseⅡelongation factor-associated factor 2，EAF2）是一种含有大量赖氨酸的RNA 聚合酶Ⅱ延伸因子［6］，被认为是参与肿瘤发生过程的抑制因子，研究发现［7］，EAF2 与前列腺癌细胞的增殖、转移密切相关，很少有研究其在肺癌中的表达特点。基于上述研究背景，运城市中心医院对Bmi-1、Caspase-3蛋白和EAF2 在肺癌中的表达水平进行了检测，探讨了其与临床病理特征的关系，以期为临床提供依据。

1 对象与方法

1.1 一般资料

选取2020 年2 月至2022 年8 月在运城市中心医院接受手术治疗的肺癌患者［3］100 例为研究对象。纳入标准：①年龄≥50 周岁；②经病理检查确诊为肺癌；③无其他严重基础疾病者；排除标准：①不愿参与本项研究者；②合并其他原发肿瘤疾病者。100 例肺癌患者中，男55 例，女45 例，年龄58～78 岁，平均（68.25±5.36）岁，临床分期：Ⅰ+Ⅱ期者35 例，Ⅲ期者65 例，有淋巴转移者30 例。选取肿瘤组织及距离肿瘤组织2 cm 的癌旁组织进行分析。本项研究经伦理委员会评审通过，且患者均知情同意。

1.2 研究方法

采用免疫组化SP 法。取肿瘤组织及癌旁组织，用4%甲醛固定，作常规石蜡切片，常规脱水脱蜡，采用3%的H2O2去除标本中的内源性过氧化物酶并对其进行抗原修复，EDTA 修复后，进行检测。依次加入Bmi-1 兔抗人一抗抗体、兔抗人EAF2 单克隆抗体、兔抗人Caspase-3 单克隆抗体（一抗稀释比例；1∶100 0）（购自美国Abcam 公司），以乳腺癌免疫组化阳性片作为阳性对照，PBS 代替一抗作为阴性对照，于4℃环境下孵育过夜。用PBS 冲洗3 次后加入二抗（稀释比例：1∶5 000），在室温下孵育30 min。行PBS 冲洗，随后进行DAB 显色、苏木素染色。得到染完色的组织切片后，将其放在高倍显微镜下观察。

参照文献评分方法［8］，对染色强度和阳性细胞（棕黄色颗粒）比率进行评分，染色强度：0 分为无着色，1 分为淡黄色；2 分为棕黄色，3 分为棕褐色；阳性细胞比率，＜5%为0 分，6%～25%为1 分，26%～50% 为2 分，51%～75% 为3 分，＞76% 为4 分。将染色强度和阳性细胞比率得分之和进行相加，总分≥4 分为阳性表达。

1.3 观察指标

观察患者癌组织和癌旁组织Bmi-1、Caspase-3蛋白、EAF2 蛋白表达的差异，比较不同临床病理特征（如TNM 分期、是否存在淋巴结转移、分化程度、肿瘤大小等）Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的不同，分析影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的因素。

1.4 统计学处理

采用SPSS 11.5 软件进行数据分析处理。计数资料用n（%）描述，采用卡方检验，采用回归分析法分析影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织和癌旁组织Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的比较

肺癌患者癌组织Bmi-1、Caspase-3 阳性表达率较癌旁组织高，EAF2 阳性表达率较癌旁组织低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 癌组织和癌旁组织Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的比较Table 1 Comparison of the expression of Bmi-1，Caspase-3 and EAF2 proteins in cancer tissues and adjacent tissues

2.2 不同临床病理特征Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的比较

TNM 分期为Ⅲ期、有淋巴结转移、分化程度为低分化、肿瘤大小≥3 cm 的肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 阳性表达率较高，EAF2 阳性表达率较低，差别有统计学意义（P＜0.05）；不同年龄、性别的肺癌患者Bmi-1、Caspase-3、EAF2 表达，差别无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的比较Table 2 Comparison of expressions of Bmi-1，Caspase-3 and EAF2 proteins in different clinicopathological features

2.3 影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2蛋白表达的因素分析

将患者的Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白阳性表达率作为因变量，以单因素有意义的因素作为自变量，进行多因素Logistic 回归分析。结果显示，淋巴转移、TNM 分期是影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的因素分析Table 3 Analysis of factors affecting the expression of Bmi-1，Caspase-3 and EAF2 proteins in lung cancer patients

3 讨论

肺癌的发病原因复杂，研究其发病机制对于预防及治疗具有重要意义。

研究发现［9-10］原癌基因Bim-1 基因在乳腺癌、食管癌等多种肿瘤细胞中呈现高表达，与肿瘤的发生发展密切相关，但对于其在肺癌中的表达机制尚不明确。在癌症治疗中涉及的不同细胞死亡过程，细胞凋亡也是研究较多的领域，细胞凋亡是细胞死亡的遗传调节形式在消除感染方面发挥重要作用受损［11］。有些细胞凋亡可导致肿瘤的发生，Caspase-3是其中主要介质是效应因子，已知它可以诱导细胞凋亡。此外，长时间自噬可导致癌细胞死亡，因此，自噬可被利用为假设的假设癌症治疗目标。有研究报道［12-13］了肿瘤抑制因子EAF2 可诱导转染细胞凋亡和抑制异种移植肿瘤的生长，抑制前列腺肿瘤生长。EAF2 是否与肺癌的发生有关有待证明。

为了探究Bim-1、Caspase-3 及EAF2 在肺癌患者中的表达特点，以期为临床诊断及治疗提供参考，本院进行了相关研究。结果显示，肺癌组织中Bmi-1和Caspase-3 的阳性表达率较癌旁组织高。EAF2阳性表达率较癌旁组织低，差异有统计学意义。在很多肿瘤组织中中发现Bmi-1 表达异常，其主要通过调节细胞周期在肿瘤发生和发展中起作用。当Bmi-1 高表达时，启动DNA 复制相关基因的转录，细胞周期进入S 期，最终加速肿瘤细胞的增殖过程。相反，当Bmi-1 表达水平低时，它可以促进细胞的衰老或凋亡。EAF2 阳性表达率较低，EAF2 可发挥抑癌基因的作用参与肿瘤细胞增殖、凋亡，EAF2蛋白与患者病情发展密切相关。Caspase-3 是半胱氨酸蛋白酶家族的成员，它在细胞凋亡途径中起着至关重要的作用切割各种关键细胞蛋白［14］。这些结果表明caspase-3 异常高表达会减弱凋亡相关途径，降低抑癌基因的表达，且还可能减弱化疗药物对机体的作用。TNM 分期为Ⅲ期、有淋巴结转移、分化程度低、肿瘤大小≥3 cm 的肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 阳性表达率较高，EAF2 阳性表达率较低。三种蛋白的水平均与肺癌发展密切相关。

将三种指标进行多因素Logistic 回归分析。结果显示，淋巴转移、TNM 分期是影响肺癌患者Bmi-1、Caspase-3 蛋白、EAF2 蛋白表达的因素。Bmi-1 的高表达与肿瘤转移，进展和恶化相关。原因是Bmi-1在作为原癌基因激活后可直接作用于细胞分裂并促进细胞增殖；另一方面，Bmi-1 表达的蛋白质可以与转移因子和肿瘤浸润因子相互作用，促进肿瘤转移和恶化，与张庆华等的报道一致［15］。基于淋巴转移、TNM 分期与肺癌患者Caspase-3 蛋白的关系来看，癌细胞存在较高分期及发生淋巴结转移，其细胞凋亡调控机制障碍程度越高，癌细胞增殖能力也较强。淋巴结转移潜能可能主要取决于caspase-3 的高表达。EAF2 蛋白低表达可促进肿瘤进展。若失去了关键caspase的表达或功能，可以呈现癌细胞对细胞凋亡有抵抗力，某些凋亡刺激可能影响治疗结果，这些发现可能具有重要意义。EAF2 蛋白在中高分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的肺癌组织中表达水平低，Bmi-1 蛋白呈高表达，提示其参与了肺癌的发生及进展过程，且EAF2可能发挥抑癌基因的功能。

综上所述，肺癌患者的Bmi-1、Caspase-3 阳性表达率较高，EAF2 阳性表达率较低，且与患者的分期、淋巴结转移情况密切相关。