王涵芝 骆诗灵 瞿思颖 柯欢笑 萧凡清 李心悦 王琳 赵宏利*

宫腔粘连（IUA）是由于子宫内膜基底层受损导致纤维组织形成，间质组织消失，组织间桥跨越子宫壁的各个方向，形成粘连［1-2］。IUA 患者常出现月经稀发、闭经、子宫内膜薄、反复流产，甚至可发生不孕［3-4］。IUA 的发病率1.7%～45.5%［5］，严重影响女性的生理心理健康。研究认为肾虚血瘀是IUA 主要的病机，治法为补肾活血［6］。赵宏利主任医师提出IUA“通补奇经法”的治疗，创立中药复方“厚胞汤”。临床上常用网络药理学来进行相关机制探讨［7-9］，本研究应用网络药理学和分子对接，对厚胞汤进行靶标预测、功能富集，筛选出与IUA 相关的活性成分、阐释其作用机制。

1 材料与方法

1.1 厚胞汤成分靶点信息 使用Batman-TCM 数据库［10］（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）检索出所有中药化合物和靶点，从而了解其功能和作用机制，选取得分＞20 分纳入。经Uniprot 数据库［11］校正，去掉非人类靶点。

1.2 IUA 靶点 在GeneCards［12］（https：//www.genecards.org/）、NCBI［13］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以及DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）三个数据库以“Intrauterine adhesion”为关键词进行人类基因检索［14］。其中，GeneCards 数据库通过对得分的中位值筛选，选出更加相关的靶点。

1.3 韦恩图 通过venny2.1 软件，将检测出的药物靶点和病变靶点加以结合，以获得共有靶点，并利用这些靶点来预测厚胞汤对IUA 的影响，从而实现作用通路的分析。

1.4 PPI 网络的构建 通过将疾病及药物的409 个共有靶点输入到数据库String［15］中，并且将“生物种类”选择为“Homo sapiens”，达到0.9 以上的可信度，就可以构造出一个PPI 网络系统。

1.5 拓扑分析 将PPI 网络插入到Cystoscape 3.8.0［16］中，应用NetworkAnalyzer 开展相关的拓扑分析，并且结合基因的degree 排序，从而确定出得分高于平均水平的基因成为重要靶点，构建相关图。

1.6 GO 富集分析 通过对药物疾病共同靶点进行的GO 生物过程、分子功能和细胞组分的富集分析。且利用String 数据库，对校正P＜0.05 的相关项目进行筛选。采用R 4.0.3 软件，设计并引入clusterProfiler、enrichplot和ggplot2 包，创建柱状图，从而实现图像的精确呈现。

1.7 KEGG 通路富集 通过KEGG 通路的富集分析方法，把药和疾病的共同靶点进行测定，并应用String 数据库，筛选校正P＜0.05 的项目。采用R 4.0.3 软件配置的clusterProfiler 包，并描绘柱状图来进行深入研究。

1.8 成分、疾病、通路、靶点网络构建 通过将Cytoscape3.8.0 中的成分、疾病、通路和靶点网络文件输入，可以更加直接揭示中医药活性成分在治疗疾病流程中的多种作用机制，从而更好地了解其作用特征。

1.9 分子对接 蛋白质数据库（https：//www.rcsb.org/）中的AKT1（PDB ID：4GV1），TP53（PDB ID：1JSP），CREBBP（PDB ID：7XI0），SRC（PDB ID：4U5J），JUN（PDB ID：5AEP）靶点蛋白晶体结构，用Pymol 2.1 软件，将蛋白分子加载到AutoDock Tools-1.5.6 软件中，对蛋白添加Gasteiger 电荷，并添加氢原子，并将原子设置为AD4 类型，保存为pdbqt 文件。化合物结构（Linoleic-Acid，Lysine，Melanin，Sebiferic-acid，Trigonelline）均来自PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通过Chem3D 将化合物转换为mol2 格式，并导入AutoDock Tools-1.5.6 软件，设置好旋转键，保存为pdbqt 文件。受体为五个蛋白靶点，五个化合物作为小分子配体，Grid Box 设置为40 Åx40 Åx40 Å，对接中心分别设为（AKT1：x=-26.449，y=2.715，z=16.133；TP53：x=2.407，y=11.751，z=40.92；CREBBP：x=4.231，y=-0.035，z=-18.851；JUN：x=32.391，y=13.273，z=-4.235；SRC：x=1.902，y=-37.006，z=10.763），Grid Spacing 设为0.375，AutoDock vina 进行批量分子对接，最后对结果进行评估。使用Pymol2.1 可视化物质和蛋白质之间的结合关系，2D 蛋白与小分子相互作用图采用Discovery Studio 2019.01 软件中的protein-ligand interction 模块。对接算法采用Lamarckian 遗传算法（最大值2,500 万次能量评估，最高次数为2,000，交叉率0.8，突变率0.02，独立对接运行100 次）的基础研究，并通过结合自由能分析最终的对接分子。然后再根据化合物的对接分数，来确定所筛选的化合物中是否存在活性成分。

2 结果

2.1 厚胞汤成分靶点信息筛选 经汇总删重后，化合物成分个数分别是阿胶3 个；柏子仁8 个；补骨脂14个；川牛膝3 个；当归83 个；枸杞子46 个；龟板6个；卷柏4 个；鹿角2 个；桑葚14 个；熟地黄4 个；菟丝子1 个；王不留行3 个；泽兰4 个。去除重复及无效值后共得到1,868 个靶点。

2.2 IUA 靶点与韦恩图的构建 GeneCards 检索到1,363 个靶点；NCBI 115 个靶点；DisGeNET 24 个靶点。把数据库合并去重后，共得到1,842 个IUA 相关基因。通过将厚胞汤靶点与IUA 靶点输入Venny 2.1 中，获得409 个两者共有的靶点（见图1）。

图1 厚胞汤-IUA交集靶点韦恩图

2.3 PPI 网络构建与拓扑分析 PPI 网络由409 个节点和1,466 条边组成，其平均度值为7.17。（见图2-3）。经过把PPI 引入Cystoscape 3.8.0 中，采用NetworkAnalyzer相关的工具展开拓扑分析，从而甄选出106 个关键的靶点，并且将排序前二十个靶点用R 4.0.3 进行绘制（见图4）。

图2 PPI网络互作图A

图3 PPI网络互作图B

图4 拓扑分析图（横坐标为每个靶点度值）

2.4 GO 富集分析 通过引入string 数据库，将药物疾病的共有靶点完成GO 富集，包括生物过程、分子功能、细胞组分，并且筛选出校正P＜0.05 的项目，共富集到3,785 条生物过程，128 项分子功能相关，241 项细胞组成相关。经分析，厚胞汤改善IUA 的细胞成分为囊泡腔、膜筏、膜微域、膜区、分泌颗粒腔、细胞顶端部分、顶端质膜、内质网腔、血小板α 颗粒、细胞质囊泡腔等；生物过程包含对药物、上皮细胞增殖、脂多糖、氧水平、细菌来源分子、上皮细胞增殖的调节、氧水平降低、活性氧代谢过程、营养水平、腺体发育等的反应；分子功能包括调节受体配体、信号受体激活、细胞因子、生长因子等活性，并与DNA 结合转录因子、泛素样蛋白连接酶、细胞因子受体、RNA 聚合酶II 特异性DNA 结合转录因子等结合（见图5）。

图5 GO富集分析图

2.5 KEGG 通路富集 通过KEGG 通路富集分析共有靶点，过滤后，富集到总共184 条信号通路。主要包括PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信号通路等（见图6）。

图6 KEGG通路富集图

2.6 成分—疾病—通路—靶点网络构建 用Cytoscape3.8.0 导入成分、疾病、通路和靶点，绘制出一张完整的通路网络图，展示出厚胞汤的活性成分在治疗IUA 过程中的特性（见图7）。

图7 成分—疾病—通路—靶点网络

2.7 分子对接 在分子对接中，结合能越低，亲和力越高，构象越稳定，结合能＜-7.0 kcal/mol 表示两个分子间有明显的结合活性。结果显示，多数化合物与靶点蛋白匹配度良好且存在较好的结合作用，综合表现最好的是Melanin 化合物。Melanin 除与TP53外，剩余对接均＜ -7.0，其中Melanin-JUN 结合能最小，为-10.8 kcal/mol，提示化合物与靶点间具有较强的亲和力。将对接后化合物与蛋白形成的复合物应用Pymol2.1 软件进行可视化，得到化合物与蛋白的结合模式，根据结合模式可以观察到化合物与蛋白口袋相结合的氨基酸残基（见图8）。Melanin 与JUN 蛋白活性口袋的VAL-863、MET-929、VAL-911、ALA-880、LEU-983 氨基酸形成较强的疏水相互作用，与GLY-993、LEU-855、LEU-932 氨基酸形成氢键相互作用，对稳定小分子有着重要贡献。

图8 JUN-Melanin分子对接

3 讨论

IUA 的发病率逐年递增，损害患者的生殖健康。此外，该病呈现高复发率的特点，临床上宫腔镜下粘连分离术可恢复宫腔体积和形状，但再粘连的复发率达3%～24%［17］。因此，放置宫内节育器、导尿管球囊、透明质酸凝胶等宫腔镜术后辅助治疗应运而生，但仍有14%～48%妇女在治疗后粘连复发［18-19］。因此，探索宫腔镜下IUA 分离术后有效的辅助治疗方法有助于女性健康。

厚胞汤是赵宏利主任医师在中医理论指导下，结合多年临床实践自拟的中药复方［20］。该汤由当归、川牛膝、王不留行、龟板、鹿角片、阿胶珠等药材组成，方中龟板填任脉以为静摄，鹿角走督脉以为温煦，当归入冲脉以为宣补，共同补养奇经，补中有动；当归补血和血，其气最雄，川牛膝活血下行，其势甚健，疏通奇经瘀滞，通中有补［21］。IUA 病因多由手术损伤引起，即属于中医“不内外因”之“金刃”直接损伤胞宫冲任，病机为“金刃伤胞，奇经受损，瘀血内阻”，治以补助通，以通为补，通补结合，共奏通补奇经。经过本课题组的前期研究，发现厚胞汤能够显著提升子宫内膜厚度和容积，同时还能够改善子宫动脉血液供应情况、提升黄体中期内膜整合素αvβ3 同时下调增生期子宫内膜相关因子的表达，临床上常用该方提高子宫内膜容受性从而有效防治IUA 松解术后的再粘连并改善相关症状［22-23］。为进一步探究厚胞汤的作用机制，本研究借助网络药理学，剖析厚胞汤防治IUA 的关键作用靶点与可能作用机制。

本研究基于网络药理学预测厚胞汤治疗IUA 的潜在机制。挖掘Batman-TCM 数据库获得药物作用靶点1,868 个，挖掘3 个数据库获得IUA 靶点1,842 个，获得交集靶点409 个。应用String 构建PPI，对Cystoscape行拓扑筛出106 个关键靶点，占总靶点数的25.9%，前20 个关键靶点为CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1、MAPK14、RXRA、EGFR、ESR1、GRB2、MYC、NR3C1、TNF、SMAD3、CREB1、FOS、NCOA2。经过String 数据库的GO 和KEGG 分析，发现厚胞汤可通过DNA 结合转录因子、泛素样蛋白连接酶、RNA 聚合酶II、细胞因子受体、激素受体等，并调节受体配体、信号受体激活、细胞因子、生长因子等活性改善IUA 相关症状，及其主要通路可能与PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信号通路等相关。

TGF-β1 被认为是纤维化的中心介质，IUA 患者和动物模型中子宫内膜纤维化面积增加，同时作为纤维化标志物的TGF - β1 表达异常上调［24］，中药可通过TGF- β1 / Smad 通路减轻IUA 大鼠子宫内膜纤维化［25］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K / AKT）信号通路被报道可被TGF - β1 激活调节成纤维细胞反应，且有研究表明KLB 蛋白可通过激活PI3K/Akt 通路增强基质细胞增殖和细胞纤维化，从而促进IUA 的发生发展［26］，FENG 等也证明补肾活血汤可激活PI3K/Akt 通路［27］。晚期糖基化终产物（AGEs）是脂质和蛋白质与几种氧化剂在衰老过程中发生非酶促反应的结果，RAGE 与肺纤维化过程和肺泡稳态有关，研究发现特发性肺纤维化患者的AGE-RAGE 比值增加［28］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种炎性细胞因子，持续的炎症会导致纤维化［29］。

Melanin 可参与抗炎、清除自由基、增强免疫功能等生理、病理活动［30］。研究发现，乌贼墨汁黑色素能通过改善肾组织的氧化应激，减轻肾基质间的纤维化通过介导PPAR-γ/TGF-β 代谢通路［31］。分子对接结果提示Melanin-JUN 对接良好，推测Melanin 在厚胞汤治疗IUA 发挥一定调节作用。

综上所述，基于网络药理学和分子对接的研究表明厚胞汤中CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、TNF、SMAD3 等可能是治疗IUA 的潜在生物标志物，厚胞汤通过PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 等信号通路调节纤维化、炎症反应、氧化应激反应，本研究对厚胞汤治疗IUA 进行了初步的理论探讨。未来通过在细胞和动物模型中的实验验证来进一步补充厚胞汤对IUA 的作用机制研究。