刘宗霖, 孙轶群, 童彤

肿瘤微环境乏氧被认为是对细胞毒性治疗(新辅助放化疗)反应不佳和肿瘤复发或转移进展的重要标志[1-5]。目前已有多种技术被用于评估乏氧如氧电极法、活检技术等[6-9]。哌莫硝唑(Pimonidazole)作为一种成熟的乏氧显像剂可直接显示细胞低氧区域,已被广泛应用于肿瘤乏氧成像研究[10]。另外,肿瘤在乏氧微环境中还会表达诸多的细胞因子,乏氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1-alpha,HIF-1α)作为一种核心转录因子,通过调节多种下游基因的表达如葡萄糖载体-1(glucose transporter-1,GLUT-1)、碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase IX,CA IX)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等,在介导肿瘤的乏氧适应性、血管生成、细胞代谢和基因组突变等方面发挥着关键作用[11]。研究[12-25]证明这些细胞因子的表达与实体肿瘤的预后相关如脑胶质瘤、头颈部恶性肿瘤、肝癌、直肠癌、宫颈癌和前列腺癌并可作为一个预测信号,协助早期调整治疗方案。虽然这些技术具有很高的应用价值,但其需要通过手术切除或其他侵入性方式获得病变标本,并进行组织学染色才能评估,过程繁琐,成本较高,因此不能作为常规临床检查手段。鉴于这一局限,越来越多的学者开始探索评估肿瘤乏氧特性的非侵入性方法。

磁共振成像(MRI)是一种广泛用于肿瘤诊断和分级的无创性检查技术,能有效地反映肿瘤的形态学特征。MRI具有多参数、多序列、多方向的特点,与传统CT相比,具有更高的软组织对比度和较高的空间分辨率[26]。同时,随着越来越多功能磁共振 (fMRI)新技术的进步和各种量化参数的引入,使定量评估肿瘤的功能特征成为可能。利用fMRI方法定量评估肿瘤微环境的乏氧状态,已在多种实体肿瘤中得到应用,并取得了一些进展。

研究现状

1.MR扩散成像

扩散加权成像(diffusion weighed imaging,DWI):是最常用的磁共振技术之一,它基于水分子的自由扩散原理,可通过表观扩散系数(apparent diffusion coefficient,ADC)来定量反映水分子扩散受限程度。目前,已有部分研究将常规DWI应用于肿瘤的乏氧成像中。在一项脑星形细胞瘤的研究中发现[27]DWI的多个定量参数与星形细胞瘤的恶性程度均具有相关性。其中,细胞密度(cell density,CD)与ADC值可较好地反映HIF-1α的水平。Huang等[28]在肝细胞癌的研究中指出ADC值与HIF-1α水平呈显著正相关(r=0.389,P=0.007)。在前列腺癌的研究中[29]ADC值与HIF-1α和VEGF的表达呈负相关。Yamada等[30]进一步将患者的预后情况纳入研究,结果发现ADC值较低的肿块型肝内胆管癌中基质更多、HIF-1α表达更高,并且患者的5年生存率也明显低于高ADC组。这一结果再一次证明肿瘤乏氧状态对患者预后的重要影响,也展现出fMRI在预测患者预后中的潜力和可行性。但是,也有另外一些研究得出了相悖的结论。早期研究表明[31,32]ADC值仅与细胞密度相关,而不能反映肿瘤区域内的氧合状态。Meyer等[33]在宫颈癌的研究中发现ADC值与VEGF、HIF-1α表达均无统计学意义。Swartz等[34]在口咽癌的研究中也发现ADC值可反应肿瘤分化水平,但与HIF-1α水平并不存在相关性。一项关于直肠癌的研究[35]研究者发现ADC值与VEGF呈负相关,但在pT4期直肠癌中并未发现相关性,而ADC值与HIF-1α水平仅存在较弱的相关性。有Meta分析[36]也得出了相似的结论,认为ADC值不可用于直肠癌HIF-1α水平的预测。造成这种矛盾结论的原因可能在于传统DWI的成像原理。虽然传统DWI可提供一定的弥散受限信息,但在真实的细胞微环境中,DWI信号强度受水分子扩散和微血管灌注的共同影响[37,38]。并且,传统DWI仅是基于水分子呈高斯运动的理想状态的理论进行成像,实际上水分子的扩散受多种细胞结构限制,因此在各个扩散方位上的分布各不相同,呈非高斯扩散运动。随着b值的升高非高斯运动越明显[39],这导致仅使用单b值模型的传统DWI不能准确地反映分子运动状态[40],从而不能反映细胞真实的乏氧微环境。因此,常规DWI用于乏氧成像的可行性仍有待进一步的研究,目前尚且存在诸多问题有待解决。

体素内不相干运动MRI(intro-voxel incoherent movement MRI,IVIM-MRI):是一种基于多b值的双指数模型,可将血管内水分子产生的信号和血管外扩散水分子产生的信号分离[38],从而同时反映水分子弥散和微循环灌注状态[37]。相较于采用单b值模型的传统DWI,IVIM-MRI通过计算得到f(体内毛细血管容积占整个容积的比值)、Dslow(D反映真实组织中水分子的扩散运动)、Dfast(D*反映毛细血管网的微循环灌注信息)等定量参数,可更准确地反映肿瘤细胞的真实微环境状态。目前已有部分研究探究其应用于乏氧成像的可能性。Homplan等[41]在一项前列腺癌的研究中提出了一种能同时反映氧气消耗和供应的新型乏氧可视化算法,他们发现由IVIM-MRI拟合的ADC值与CD相关,血容量分数(fractional blood volume,fBV)与血管密度(blood vessel density,BVD)相关,从而将ADC值与氧气消耗、BV与氧气供应联系起来。并且经哌莫硝唑染色证实,利用这种算法得出的低氧分数与乏氧情况有很强的相关性。Li等[42]在软组织肉瘤的研究中发现HIF-1α的表达与传统DWI的ADC值无相关性,但与D值呈负相关(r=-0.469),与f值呈正相关(r=0.572)。肝细胞癌研究中[43]HIF-1α的表达与D值、f值均呈负相关(r=-0.673;-0.737)。早期宫颈癌中HIF-1α高表达组较低表达组有更高的f值和D值(P=0.02;0.02)[44]。并且,f值也与VEGF表达存在强相关(P=0.001)[45]。另外,在一项食管癌的研究中发现[46]D*值与VEGF表达也存在正相关(r=0.335,P<0.05)。上述研究表明虽然在不同肿瘤中IVIM参数指标与乏氧相关因子表达水平的相关性强弱及方向有所差异,这可能由病理类型、组织学分级或检查设备参数差异等多种因素造成。但较常规DWI而言,由于其成像原理更加符合真实细胞情况,所以IVIM-MRI在乏氧成像方面表现出更强的可行性,在未来肿瘤乏氧成像中具有广阔的应用前景。

扩散峰度成像(diffusion kurtosis imaging,DKI):是另一种基于非高斯分布的MRI技术,通常需要使用多个较高的b值和梯度扩散方向才可采集出较为完整的DKI图像[47]。它通过峰度(kurtosis,K)、平均峰度系数(mean kurtosis,MK)、轴向峰度系数(axial kurtosis,AK)、径向峰度系数(radial kurtosis,RK)、平均扩散率(mean diffusivity,MD)等参数来定量描述扩散偏离高斯分布的程度,并可衡量组织结构的复杂程度[48]。房亚军等[49]在兔恶性骨肿瘤模型中发现VEGF在肿瘤实性区与微观浸润区中的表达存在显著差异(P<0.001),并且MD值与两个区域中的VEGF表达均呈负相关(r=-0.726/-0.697,P<0.05)。Li等[42]将其用于软组织肉瘤的乏氧研究,发现HIF-1α表达水平与MK值呈正相关(r=0.779),与MD值也呈负相关(r=-0.588),并且通过分别绘制IVIM和DKI各参数的ROC曲线,发现MK值的预测性能最好。上述研究均显示出DKI对肿瘤乏氧相关因子良好的敏感性。肿瘤在低氧条件下HIF-1α表达增强,并诱导下游的VEGF表达是血管生成活动增强。这种乏氧所诱导的新生血管通常形态不规则并伴有血管壁完整性受损,从而造成局部组织坏死,加剧局部结构的复杂性,导致细胞运动更加偏离高斯分布。这一现象可直接体现在MK值的变化上。另外,结果也表明与传统DWI生成的ADC值相比,MD值可更准确地反映组织中复杂成分引起的水分子的弥散受限情况。但由于目前DKI用于肿瘤乏氧成像的研究极少,仅有上述两文涉及此类问题。因此,DKI用于乏氧成像的研究潜力巨大,结论还需经过未来更多的研究所论证。

弥散频谱成像(diffusion spectrum imaging,DSI):除上述扩散成像技术外,DSI技术也在近年来逐渐进入研究者的视线。它也是一种基于多b值多方向的成像技术,通过计算q空间衰减回波信号与水分子扩散概率密度函数的傅立叶关系,在多个方向上获得一系列的扩散加权图像[50]。广义分数各项异性(generalized fractional anisotropy,GFA)为其主要定量指标,可有效反应水分子在组织内各个方向上的扩散差异性。目前DSI用于肿瘤微环境乏氧成像的研究鲜有报道。Dovlo等[51]基于传统的DSI模型开发了一种新型的相位过滤差分光声技术,即波长调制差分光声雷达(wavelength-modulated differential photoacoustic radar,WM-DPAR)成像可显著抑制背景吸收并放大两个光声信号的差异。基于这一特点,WM-DPAR成像可检测到总血红蛋白浓度和血红蛋白氧合度的微小变化,从而有利于肿瘤的早期识别和乏氧微环境监测。通过免疫组化染色的方法,这一结论在动物实验上得到了验证,WM-DPAR成像可较为准确的显示组织氧饱和度。虽然该研究展示了DSI在肿瘤微环境乏氧评估中的应用潜力,但其扫描时间长、数据采样要求高等特点仍是制约其进一步研究与应用的主要障碍。随着各种新型后处理技术的引入,未来DSI在该领域的应用前景有望进一步拓宽。

2.动态增强MRI(dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)

DCE-MRI通过静脉注射顺磁性低分子量对比剂,并在短时间内记录多个图像来研究对比剂在器官或肿瘤中的摄取情况,不仅可计算出相对强度(relative enhancement,RE)、最大相对强度(maximum relative enhancement,MRE)、最大强度(maximum relative enhancement,ME)、流入速率(wash-in rate,WIR)、流出速率(wash-out rate,WOR)、达峰时间(time to peak,TTP)等半定量参数,还可获得内皮转移常数(endothelial transfer constant,Ktrans)、血管外细胞外腔容积分数(fractional extravascular extracellular space volume,Ve)、速率常数(rate constant,Kep)等定量参数[52],提供肿瘤组织的生理和代谢信息[53]。肿瘤细胞乏氧主要由低血流灌注和高细胞密度造成,DCE-MRI可以潜在地用于识别这些区域[54]。已有研究表明[55,56]DCE-MRI定量图像参数与肿瘤乏氧有显著相关性,认为该技术可用于评估肿瘤乏氧。在宫颈癌[57]和胰腺癌[58]的体外异体移植模型研究中均发现Ktrans与哌莫硝唑染色结果呈显著的负相关。并且,这一结果在患者模型中也得到证实[59]。在脑胶质瘤的小鼠模型[60]和临床模型[61]研究中也均发现Ktrans值和Ve值与HIF-1α的表达存在明显的相关性(P<0.001),并且HIF-1α水平与胶质瘤恶性程度的分级也有明显关联(P<0.001)。鼻咽癌的研究中RE值、ME值、MRE值与HIF-1α表达呈正相关[62], Ktrans值和Kep值与HIF-1α表达呈显著负相关[44]。另外,潘江洋等[63]在兔 VX2肝种植瘤模型中也发现Ktrans值与VEGF表达呈正相关(r=0.651)。然而,前列腺癌的研究中[64]并未发现DCE-MRI参数与HIF-1α存在相关性。目前,相对的非特异性和不同成像设备之间缺乏方法学标准化仍是DCE-MRI需要克服改进的关键问题,这会使得结果的重复性存在困难。鉴于其对肿瘤血流和灌注信息的动态定量反映的优势,其在肿瘤乏氧成像中的应用依然存在潜力。

3.血氧水平依赖MRI(blood oxygen level dependent MRI,BOLD-MRI)

血液中脱氧血红蛋白为顺磁性物质。当血液中的脱氧血红蛋白的浓度增加时,血管周围的微观磁场将发生变化,造成质子的T2弛豫时间减少,局部信号降低[65]。BOLD-MRI利用这一原理,通过自旋去相位的速率(R2*)参数估量脱氧血红蛋白含量,从而反映肿瘤氧分压变化及乏氧状态[66]。多项研究表明R2*值与氧分压有显著联系[67,68]。肿瘤R2*和氧诱导ΔR2*与肿瘤乏氧和氧合改善的关系,也已经在一系列临床前肿瘤模型中得到证实[69-72],R2*值的降低可有效反映体内肿瘤氧合程度的增加[73]。研究表明[74]R2*值与哌莫硝唑染色结果之间存在显著联系。他们发现R2*对肿瘤乏氧的敏感度较高(88%),但特异度较低(36%)。Panek等[75]将BOLD应用于头颈部恶性肿瘤的研究中,检测到肿瘤自发的R2*值波动。他们发现这种波动仅与灌注受损区域相关,而与慢性乏氧区域相关性不佳,进而判断出肿瘤微环境中还存在循环乏氧。另外,McPhail和Robinson[72]在大鼠乳腺肿瘤模型中也发现了哌莫硝唑加合物与R2*值具有良好的相关性。矛盾的是处于低氧状态的肿瘤数量越少,R2*值反而更高。这表明R2*值与肿瘤乏氧的关系还需要在一系列不同类型的肿瘤中得到进一步证实。上述一系列研究表明BOLD-MRI参数对肿瘤微环境的乏氧状态有良好的检测能力,为其进一步应用于肿瘤乏氧相关细胞因子水平的评估提供了可能性。一项乳腺癌的研究中[76]研究者发现R2*与CA IX水平呈正相关,但与VEGF水平无显著相关性。这表明BOLD - MRI可以评估肿瘤的慢性乏氧。然而在探究R2*与肿瘤HIF-1α表达水平的少量研究中结果却并不理想。Li等[77]在肾癌的动物研究中发现HIF-1α水平与肿瘤R2*值不存在相关性。早期宫颈癌中[45]HIF-1α水平与R2*值存在中度相关(r=0.491,P<0.001)。乳腺浸润性导管癌中[78]肿瘤的平均R2*值也仅与HIF-1α水平存在中度相关(r=0.516,P<0.001)。因此,BOLD-MRI用于肿瘤乏氧相关因子评估的研究还相对匮乏,还需要大量实验佐证其应用价值。

由于BOLD图像采集过程中需要通过引入麻醉剂、胰岛素诱导低血糖和吸入气体混合物等方式(改变代谢需求和血流)引起血液氧合状态发生变化,方法较为繁琐,不适合用于临床常规检查[79]。并且,R2*值与氧分压并非呈线性关系[80],R2*值也仅反映血管内脱氧血红蛋白含量,而并不能直接反映肿瘤乏氧状况。鉴于这一系列的局限性,研究者们开发出定量BOLD(quantitative BOLD, qBOLD)模型。它在大幅缩短扫描时间的同时保持了较高的信噪比,并可直接测量局部或总体血氧饱和度水平[81-83]。但是,目前只有极少数的研究将qBOLD应用于肿瘤乏氧成像。Bennani-Baiti等[84]在侵袭性乳腺癌的研究中发现氧萃取率(OEF)、氧代谢率(MRO2)、线粒体氧张力(MitoPO2)均可较好反应肿瘤的乏氧状态和肿瘤的侵袭性。Maralani等[85]在研究侵袭性星形细胞瘤的乏氧情况时应用qBOLD生成组织氧饱和度(StO2)图,发现CA IX在高StO2位置与低StO2位置之间存在差异。

4.磁共振波谱(magnetic resonance spectrum,MRS)

质子的共振频率与质子周围电子云产生的磁屏蔽作用密切相关。由于人体内各种代谢物中的质子所处的化学环境各不相同,导致这些代谢物的共振频率出现差异,在MRS上表现为不同的吸收峰位置,吸收峰高度即可反映对应代谢物的浓度。正常人体中各种代谢物的浓度总是相对稳定的,因此当代谢物浓度发生变化时即可提示人体内存在病理生理变化,这一变化可被MRS敏感识别。目前,这一技术已广泛应用于肿瘤的乏氧评估,如利用19F-MRS可检测肿瘤内乏氧相关代谢物2-硝基咪唑的储留量,以及利用全氟化碳(perfluorocarbon,PFCs)19F-MRS可检测肿瘤的氧张力变化。近期,O'Neill等[86]通过将钴(Co)复合物作为磁共振成像对比剂,利用质子磁共振波谱成像(1H-MRS)监测从双磁性Co(III)还原到顺磁性Co(II)所引起的水信号变化来监测生物还原。肿瘤微环境乏氧的状态下这种Co源生物还原性药物可被激活,而在常氧健康条件下毒副作用较低。这种方法间接评估了肿瘤微环境的乏氧状态并为Co源生物还原性药物用于肿瘤的治疗提供了指导。过去的一项研究利用18F-氟米尼达唑(18F-FMISO)PET量化了脑胶质瘤的乏氧情况。Ratai等[87]在此基础上进一步探究1H-MRS作为脑胶质瘤患者预后标志物的潜力。结果发现MRS标记物N-乙酰天门冬氨酸(NAA)/胆碱(Cho)在肿瘤中(AUC=0.83)和肿瘤周围区域(AUC=0.95)均对患者的1年生存有预测作用,肿瘤中较高的乳酸(Lac)/肌酸水平与较差的预后密切相关 (AUC=0.79)。虽然上述研究结果均表现了MRS在肿瘤乏氧检测中的可行性,但利用该技术直接对乏氧水平进行评估的研究尚未报道。MRS检测的物质大多不具有特异性,这可能是阻碍其进一步应用的重要原因。但是,随着各种新技术的引入,MRS对物质的特异性识别的能力将得到进一步增强。因此未来有望在肿瘤乏氧定量评估领域得到更深入的应用。

5.电子顺磁共振成像(electron paramagnetic resonance imaging,EPRI)

人体内包括乏氧在内的各种病理因素会导致大量的自由基生成,这些自由基均含有至少一个的未成对电子。EPR利用这一原理,通过引入不同的可与自由基结合的顺磁性对比剂,从而检测自由基在人体内的空间分布。目前EPR在肿瘤乏氧微环境的检测中已取得了一些进展如通过氧化亚氮、印度墨汁(india ink)、活性炭 (charcoal)和锂酞菁(lithium phthalocyanine,LiPc)等顺磁性对比剂可检测组织乏氧水平[88]。近期,Swartz等[89]开展了一项关于EPR血氧计临床应用的系统性多中心研究,通过3种互补形式的材料(印度墨水、OxyChips和可植入谐振器)评估微粒氧敏感EPR的临床价值,结果表明OxyChips可使传感器与对比剂的最大距离扩大至20 mm,这将极大地增强表面谐振器的应用,从而对更深层次的肿瘤进行评估。Krzykawska-Serda等[90]在小鼠立体定向MCa4肿瘤组织中,利用三苯甲基自旋探针作为EPR对比剂对乏氧区域进行评估,并使用ELISA检测3种乏氧标志物(HIF-1α、VEGF、CA IX),结果表明EPR识别的低氧部分与HIF-1α、VEGF和CA IX之间具有很强的关联性。这再一次证实了EPR对肿瘤乏氧区域的识别能力。另外,鉴于目前大多数确定可用于氧气水平测量的EPR材料大多不能应用于医疗,Desmet等[91]探究了Carbo-Rep®(一种用作术前肿瘤定位的液体标记的木炭悬浮液)的磁性特征是否可用于EPR乏氧成像,结果在Carbo-Rep®中发现了呈现出高氧敏感性的顺磁中心。当切换呼吸源时大鼠的肿瘤中可监测到氧合的细微变化。这表明Carbo-Rep®的磁性特征未来有望在临床EPR血氧仪中进行应用。尽管如此,EPR显像剂大多为非医疗材料的这一特点依然限制了其在临床中的广泛应用,故未来还需进一步探索医用材料用于EPR现象的可能性。

6.全氟化碳MRI(perfluorocarbon MRI,PFC-MRI)

临床应用MRI大多是基于氢原子核(1H)进行成像。除此之外,基于19F的MRI技术也已被广泛报道。由于人体软组织中不存在19F,故其产生的MR信号完全来自外源性引入的19F对比剂,这造就了其高信噪比及定量成像的特性[92]。目前,PFC纳米粒子被认为是19F-MR一种良好的定量对比剂,其化学结构稳定,几乎不与其他物质发生化学反应,可与脂质载体进入血液循环,最终经肺排出体外[93]。同时,PFC具备较强的携氧能力,当PFC经过乏氧组织时,溶解在其中的氧可较容易的被提取,这为其用于肿瘤乏氧成像提供了可能性。目前已有多项研究表明其对组织氧分压评估的可行性[94-96]。近期,Zhou等开发了一种搭载PFC和依托泊苷(EP)的Fe3O4中空多孔治疗纳米平台(PHMNPs)。结果表明PHMNPs能够在较长时间内向实体肿瘤输送氧气,从而有效地降低肿瘤细胞对低氧诱导的EP抵抗,并同时对氧气递送过程进行MR成像。尽管PFC-MRI在乏氧成像中表现出巨大的潜力,但其依然存在一些缺陷有待解决。例如,虽然由于人体内缺少19F成就了其高特异性的优点,但背景信号的缺失使采样参数优化及运动伪影的评估变得更加困难。因此,将应用于肿瘤乏氧的定量评估还需进一步探索与优化。

目前,应用fMRI方法评估肿瘤微环境乏氧水平已取得一定的进展,各种fMRI具有其独特的优缺点,但是在应用过程中仍存在诸多问题有待解决。①图像分割问题:目前大多采用手动分割方式选取ROI,由于各操作者水平不一,加之缺乏统一的分割标准,不同研究者所获得的分割区域特征有一定差异。由于肿瘤坏死区域总是乏氧的,分割时误将坏死区域纳入将影响最终的结果。虽然已出现半自动或全自动分割方法,但仍不能应用于所有图像。②影像参数标准化问题:临床应用中由于各中心、各机器参数设置缺乏统一标准,因此难以准确评价和比较不同实验结果及成像参数[97]。③影像-病理匹配性问题:目前大多数研究仅是采用取平均值的方法,在ROI和病理切片中获得研究参数,并未对图像与病理标本进行点对点匹配,这会对结论可靠性产生影响。虽然已有少量研究应用特殊方式提高影像-病理匹配性,如MRI-神经导航立体定向活检技术(MRI-neuronavigation stereotactic biopsies)[61]与体表标记定位[42]等技术,但仍未开发出适用于所有肿瘤或区域的匹配方法。上述问题均会对方法的可行性及结果的可靠性产生一定的影响。总之,fMRI乏氧成像拥有广阔的发展空间,需要更多的研究证实及确定最佳预测参数。并且,随着影像组学及人工智能等技术的发展,研究者可进一步挖掘经肉眼无法辨别的高维度特征,从而更深层次的探究细胞微环境信息,为乏氧的精准识别和可视化提供更多可能性。因此,fMRI日后必将成为探索肿瘤微环境和肿瘤精准个体化医疗的重要工具,为肿瘤诊疗方案的选择与制订提供重要的参考与指导。