袁红朝,贺 珍,张丽萍,耿梅梅,许丽卫,陈 闻,彭 灿,李春勇,唐思宇,孙德慧,钟 欢,王久荣

(中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室,长沙 410125)

提升土壤的“碳汇”潜力是目前最有效的减缓大气CO2浓度升高的途径之一,也是国家实现“双碳”目标的重要举措。土壤碳代谢是土壤“碳汇”研究的重要内容,而土壤糖类化合物为土壤微生物驱动的碳代谢过程提供主要的能源和碳源[1]。因此,科学地认识土壤糖类化合物及其对土壤微生物活性的调节作用,对于深入理解土壤有机质矿化和累积过程,进一步发挥土壤“碳汇”功能有着重要意义[2]。

土壤糖类化合物是由碳、氢、氧三种元素组成的有机物,是多羟基醛酮以及它们的多聚体, 约占土壤碳库的5%～20%。土壤中的糖类化合物一般分为单糖、低聚糖、多糖及糖类衍生物等[3-4],主要来自动植物残体、根系分泌物、微生物细胞以及胞外代谢产物等。土壤中的糖类化合物主要以多糖形式存在,包括氨基糖、纤维素、半纤维素、淀粉和几丁质等。多糖一般难溶于水,也是土壤团粒结构的重要胶合物质,其中微生物源多糖(主要为氨基糖)与黏粒结合形成微团聚体是土壤团聚结构形成的起始步骤[5-7]。多糖在胞外水解酶作用下可分解为低聚糖,进一步水解为单糖后被微生物利用,而不同来源的多糖水解后的单糖组分不同。单糖和低聚糖具备快速周转和高度可溶性等特点,与微生物活性显著相关[8],因此,在前期研究中,土壤糖类化合物含量和特性是土壤“碳汇”研究中的重要指标和主要对象,但是对于糖类化合物在植物-土壤-微生物系统中代谢过程及其影响因素研究还较少。稳定同位素技术在我国生态学研究中的应用发展非常迅速,稳定碳同位素技术也成为研究土壤碳循环最科学有效的方法之一[9]。土壤糖类化合物作为生物标识物结合稳定碳同位素示踪技术,可定量研究糖类化合物在植物-土壤-微生物间的流通与转化过程[10-13],为土壤碳代谢及其与微生物活性与功能调控等方面的研究提供关键技术支撑。

采用稳定碳同位素示踪技术研究土壤碳代谢过程时,准确定量土壤中糖类化合物的碳同位素丰度非常重要。目前,土壤糖类化合物碳稳定同位素分析技术主要包括有机质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和稳定同位素质谱法(IRMS)。IRMS测定碳同位素比值的精度和准确性一般比MS高,且IRMS检测所需的标记量远低于MS,能有效降低实验所需成本[14]。NMR仅能对糖类化合物大类进行分析,不能定性到具体组分[15]。综合比较,IRMS可以对糖类化合物进行分类定性鉴别,且分析的灵敏度和精度高,性能最优,已在土壤碳代谢研究中得到广泛应用。然而,土壤中的糖类化合物不能直接进行上机分析,需要进行相应的前处理转化,如水解提取、分离、组分纯化及衍生等(图1)。而前处理方法是否合适,将会直接影响分析结果的准确性。此外,土壤样品还存在基质复杂、糖类化合物浓度低和极性高等问题。为此,本研究综述了目前国内外土壤糖类化合物的水解、纯化和碳稳定同位素分析方法,以及这些分析技术在土壤碳代谢研究中的应用情况,以期推进土壤中糖类化合物研究的发展。

图1 土壤糖类化合物碳稳定同位素分析的流程图Fig.1 Workflow of soil carbohydrates stable carbon isotope analysis

1 土壤中糖类化合物的前处理

1.1 提取方法

土壤糖类化合物组成复杂,主要包括单糖、二糖、多糖以及糖类衍生物,其中大多数以多糖形式存在,但通常均以单糖形式表示,因此分析糖类化合物时,通常需将二糖、多糖及糖类衍生物酸水解为单糖来提取[16-19]。多糖与土壤其他组分之间的联结复杂,主要相互作用力是氢键和共价键,水解的目的是破坏它们之间的键合作用,将多糖释放出来后水解为单糖。多糖酸水解效率受酸种类、浓度、水解时间、水解温度以及多糖的键合类型等多种因素的影响[20-26]。目前,多糖酸水解提取常用的水解试剂为盐酸、硫酸和三氟乙酸等,见表1。其中,盐酸一般用于土壤中氨基糖的水解提取。Zhu等[21]比较了沉积物经不同盐酸水解处理后的定量和成分分析,发现稀盐酸(1 mol·L-1)室温下预水解2 h,然后梯度升温至105 ℃保持2 h,最后用浓盐酸(6 mol· L-1)在105 ℃下继续水解8 h的程序最优。同一样品使用该程序水解得到的氨基糖和糖醇类组分的含量均比传统一步酸水解方法[19]提高了约60%。硫酸一般用来水解纤维素、半纤维素和淀粉等中性糖,采用两步水解程序,即直接用浓硫酸(12 mol· L-1)浸泡,再用稀硫酸(1.2 mol ·L-1)水解,其中浓硫酸主要水解纤维素形式的多糖,稀硫酸则主要水解非纤维素形式的多糖[24-25]。三氟乙酸则不仅可以水解纤维素、半纤维素、淀粉等中性糖,也可以水解含羧基或硫酸根的多糖,如微生物来源的胞壁酸等。通过对不同三氟乙酸浓度(如2、4和6 mol·L-1)、不同的水解温度和时间的水解效果进行比较,发现使用4 mol·L-1三氟乙酸在105 ℃下水解4～6 h的组合,土壤中多糖化合物的水解提取效率最高[17,22-23]。

表1 土壤中糖类化合物常用的酸水解提取方法Table 1 Comparison for acid extraction methods of soil carbohydrates

如果仅研究土壤中的单糖类等易溶于水的糖类化合物可以直接采用水提取方法[27-31]。根据提取温度分为热水提取和冷水提取,列于表2。Chantigny等[31]以新西兰和加拿大东部4种农业土壤为研究对象,考察了冷水(20 ℃)/热水(80 ℃)提取和提取时间(10 min～24 h)对土壤水溶性有机物组成的影响,结果表明,80 ℃提取时所有组分含量都高于20 ℃提取,而20 ℃下提取的葡萄糖浓度随着提取时间的增加而下降。归其原因可能是:① 在较高温度下土壤可溶性糖类的溶解性增加;② 高温抑制了微生物对土壤单糖的利用,因此延长提取时间会提高提取效率,而常温下则相反,单糖含量随着提取时间的增加而下降。Ghani等[27]也发现使用80 ℃热水提取16 h得到的糖类化合物的比例可达到40%以上。

表2 土壤中糖类化合物常用的水提取方法Table 2 Comparison for water extraction methods of soil carbohydrates

1.2 分离纯化方法

水提取的样品纯化步骤比较简单,仅需要先通过0.45μm硝酸纤维素膜过滤除杂,滤液再根据分析目标物选择合适的纯化小柱分离纯化后即可用于后续分析。

2 土壤糖类化合物碳稳定同位素质谱分析技术

目前土壤中糖类化合物的碳稳定同位素质谱分析方法主要有:元素分析仪-稳定同位素质谱法(EA-IRMS)[32]、总有机碳分析仪-稳定同位素质谱法(TOC-IRMS)[33]、液相色谱-稳定同位素质谱法(LC-C-IRMS)[34-35]、热裂解气相色谱-稳定同位素质谱法(Py-GC-C-IRMS)[36-37]、气相色谱-稳定同位素质谱法(GC-C-IRMS)[38-40]等5种,可大致归为以下两大类。

2.1 总糖碳稳定同位素分析方法

EA-IRMS和TOC-IRMS方法适合不需要确定到特定糖种类的土壤糖类化合物碳同位素研究。由于其不具备组分分离定性能力,因此仅能对提取纯化后的土壤总糖进行碳稳定同位素分析。该方法需要的样品量较多(样品中需要含有5 μg C以上),测定结果易受共提取的其他可溶性碳,如酚类、氨基酸和有机酸等的干扰[32-33]。

2.2 单体糖碳稳定同位素分析方法

当涉及单体糖类组分的稳定同位素分析时,则需要利用色谱分离技术结合稳定同位素质谱仪,如Py-GC-C-IRMS,LC-C-IRMS或GC-C-IRMS等,对提取土壤糖的单体糖组分进行定性、定量及碳同位素丰度分析[34-41],列于表3。

表3 土壤中单体糖的碳稳定同位素分析方法Table 3 Comparison of soil carbohydrates compound-specific stable-C-isotope analysis

其中,Py-GC-C-IRMS的检测目标物为裂解物,可根据已有文献将裂解产物对原化合物组分进行有效归类(如碳水化合物、木质素、蛋白质和脂质),具备样品制备快速,无需衍生化以及良好的灵敏度等优点。但存在低热解产率或色谱分离不足等问题对检测造成干扰,影响分析结果的准确性。

GC-C-IRMS是目前糖类化合物碳稳定同位素分析最常用的技术,然而,糖类化合物需要衍生化后才能进行检测分析[12]。衍生方法常见的不足包括衍生处理耗时长、衍生试剂不稳定以及异构体导致的复杂色谱峰型等,而且衍生化试剂中碳原子的加入,导致化合物中的13C/12C比值发生变化,结果还需要进行校正[12]。常用的三种衍生方法为三甲基硅基化[38-39]、乙醛糖醇衍生法[40,45-46]和甲基硼[47],列于表4。其中,三甲基硅烷化法在对单糖类化合物阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖等进行13C分析时会出现多个异构体峰,引入的外源碳也需要进行校正。乙醛糖醇衍生法可用于对单糖物质,如鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、核糖等分析,方法的分析精度可达0.3‰,在衍生过程中碳键的断裂引起的分馏可以进行校正,且引入的外源碳量最少。但衍生产物随机性大,后续对结果的校正相对繁琐。甲基硼衍生方法可用于对单糖类,如阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、果糖和葡萄糖进行分析,方法快速简便,且在衍生过程中不涉及同位素分馏,得到的13C值更精确,但过量甲基硼的去除操作较为复杂。优化甲基硼衍生测定土壤中单糖的方法,并对其精密度和准确度进行评价,是今后的一个研究方向。

表4 土壤中糖GC-C-IRMS测定的衍生方法比较Table 4 Comparison for GC-C-IRMS derivation methods of soil sugar stable-C-isotope analysis

综上所述,由于土壤糖类化合物成分复杂、各类型间差异大,因此在开展相关研究时,需要根据样品类型和成分差异,结合研究目的和精度要求,选择合适的糖类化合物碳稳定同位素分析前处理和分析方法,尽量避免同位素分馏,从而获得准确可靠的研究结果。

3 糖类化合物碳稳定同位素技术在土壤碳代谢研究中的应用

糖类化合物的碳稳定同位素技术通常用于追踪土壤碳代谢中糖类化合物的来源,或量化土壤中糖类化合物的碳代谢过程等。如通过量化土壤中(半乳糖+甘露糖)与(阿拉伯糖+木糖)的比例,分析土壤中糖的初级(植物来源)和次级(微生物来源和SOM来源)来源。Ekberg等[36]通过Py-GC/MS-C-IRMS分析了土壤可溶性糖类化合物的组成和碳稳定同位素值,根据热解产物性质进行分组获得的主要前体来源为多糖、蛋白质或混合来源(主要是木质素和蛋白质的衍生物)。且随着作物生长季的推进,三组前体的碳稳定同位素值都有所增加,表明随着外源有机物快速被微生物利用周转不断向土壤碳库输入。Derrien等[39]通过13CO2脉冲标记结合GC-C-IRMS分析技术,追踪了碳在植物-土壤系统流通,以揭示植物根际沉积碳特别是糖类化合物的性质和动态。研究发现,以聚合物的形式存在的葡萄糖是根际沉积碳的主要部分,40%的根际碳以中性糖的形式存在,并且微生物来源糖表现出随时间增加,根际糖迅速趋于稳定向土壤有机质方向积累的特征。

此外,糖类化合物是土壤物质代谢的主要能源、碳源和驱动力,其变化规律可指示土壤有机碳库的总体变化[48]。其中,土壤可溶性糖是土壤有机碳源中最活跃的碳源,维持和刺激根际和碎屑层中的微生物活动,从而调控土壤有机质分解和激发效应来推动土壤养分循环过程[49]。应用糖类化合物的碳稳定同位素技术量化糖矿化的初始速率、平均滞留时间(MRT)、进入到微生物生物量的MRT以及进入到土壤有机质的MRT等,可以评估糖在土壤剖面的迁移、植物和微生物吸收与利用效率等。Fischer等[50]选取了代表性可溶性糖(葡萄糖)研究其在不同浓度范围内被土壤固定和微生物利用的速率,发现葡萄糖的转化速度非常快,大部分在30 min内完成了周转。在较低浓度范围时(<100 μmol/L)糖类碳大部分被利用到微生物生物量中,但当浓度增加时,糖类碳开始倾向于矿化为CO2。该研究指出,可溶性糖类的矿化速率主要受微生物吸收和利用控制,物理过程如吸附的贡献较少,并且利用的偏好主要取决于其浓度。Qiu等[51]通过比较水稻土和旱地土壤之间可溶性糖类化合物的代谢差异,发现水稻土中矿化作用和激发效应普遍弱于旱地土壤,揭示了水稻土具有较高土壤有机质储量的内在机制(如矿化缓慢、负激发效应)。

4 问题与展望

随着糖类化合物的碳稳定同位素分析技术的广泛应用,对土壤中糖类化合物的来源、转化过程和累积规律等的理解也在不断加深。但仍存在许多不足,有待进一步研究。

4.1 前处理

目前的土壤糖类化合物水解提取方法各有偏好,还没有一种方法能将土壤中糖类化合物全部水解出来,如果能同时水解出更多糖类物质,将会提高糖类化合物研究的整体性,这将是今后土壤糖类化合物水解研究的一个发展方向。此外,土壤糖类化合物的前处理过程多涉及复杂的水解、纯化及衍生等步骤,大部分由人工操作完成,需要较高的人力和时间成本,并且对操作人员的熟练程度有较高要求,在未来需要研究开发自动化前处理设备,实现前处理流程的自动化操作,以减少人为操作的干扰,不仅可以提高分析效率,也能增加研究结果的可靠性。

4.2 分析技术

目前糖类化合物的碳同位素分析方法多集中在氨基糖、中性单糖类,对单糖的聚合物和糖类衍生物等的分析技术还比较少,有待进一步研究探索。

4.3 应用研究

利用碳稳定同位素标记,研究外源糖类化合物进入土壤后在各粒级团聚体中的累积规律,评价糖类化合物在团聚体形成中的作用;同时结合核酸探针(DNA-SIP)技术,解析糖类化合物在土壤不同粒径中周转的微生物过程,评估其对SOM形成和碳固定的贡献。在以上研究的基础上,再进一步探索不同土壤利用措施下,外源糖类化合物在土壤中转化与累积的差异,开发有利于外源糖类化合物在土壤中积聚的有效技术和途径,以期提升土壤“碳汇”潜力,助力国家“双碳目标”的实现。这些都将会是未来研究的热点方向。