李祥弟,徐婷,刘占,张丽杰,王栋*

1(酿造微生物与应用酶学研究室(江南大学),江苏 无锡,214122) 2(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学), 江苏 无锡,214122) 3(广东美味鲜调味食品有限公司,广东 中山,528400)

酱油是一种在东亚地区不可缺少的发酵调味品,因其浓郁的鲜味和独特的香气在世界范围内也广受欢迎。酱油的制作过程大致可分为4个部分,即原料蒸煮、制曲、酱醪发酵以及灭菌罐装[1]。成熟酱醪的理化性质和风味特征与酱油品质密切相关,因此,酱醪发酵是酱油生产的关键阶段之一。在酱醪发酵过程中,耐盐乳酸菌起到了至关重要的作用[2]。在酱醪发酵前期,耐盐乳酸菌会代谢产生有机酸,降低发酵体系pH以有利于产香酵母菌的增殖。同时,耐盐乳酸菌可以起到提升风味[3]、抑制有害微生物生长[4]、抑制有毒物质形成[5-6]等作用。

嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)属于四联球菌属(Tetragenococcus),表现为兼性厌氧发酵模式,可以在高盐(20% NaCl)或高糖的环境中生长,是我国高盐稀态酱油发酵过程(自发发酵)中的主体耐盐乳酸菌。有报道显示,嗜盐四联球菌可以提高酱油中风味物质含量,是日本酱油、鱼酱等纯菌发酵过程中的初始发酵菌剂(starter)。不仅如此,嗜盐四联球菌与酱油主体产香菌鲁氏结合酵母(Zygosaccharomycesrouxi)具有种间相互作用,前者可以有效提高鲁氏结合酵母的耐盐性[7]。因此两菌种共培养可以进一步提高酱油中风味物质含量。然而,对嗜盐四联球菌的泛基因组研究表明,与菌种发酵性能对应,该种不同株的基因组呈现明显的菌株水平特异性,即不同菌种在菌种安全性、产香性能、风味增强等方面具有明显差异。因此,筛选具有优良特性的嗜盐四联球菌以用于我国高盐稀态酱油酱醪发酵,对进一步提高酱油品质具有重要潜在价值[8-10]。

四乙基愈创木酚(4-ethylguaiacol, 4-EG)是酱油中一种关键的风味物质,呈烟熏及辛香味,具有缓和咸味的作用。四乙基愈创木酚风味阈值极低,样品间0.5 mg/L的差异就能被人体感官识别,因此其含量与酱油品质密切相关。已有研究表明,微生物合成四乙基愈创木酚主要以阿魏酸为前体,通过阿魏酸脱羧酶,转化为四乙烯基愈创木酚,后经四乙烯基愈创木酚还原酶转化为四乙基愈创木酚。且已有研究表明强化四乙基愈创木酚产生菌可以提高酱油中四乙基愈创木酚的含量[11]。

本文尝试从酱油酱醪中分离筛选出高产四乙基愈创木酚的耐盐乳酸菌,对其进行种属鉴定,并测试该菌种耐酸耐盐性能及菌种安全性能。以该菌种为初始发酵菌剂用于模拟酱油发酵,与不加发酵剂的酱油发酵样本相比,四乙基愈创木酚含量提高3.34倍。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

菌株筛选样品,国内某酱油厂酱醪;制曲用米曲霉沪酿3.042,江南大学酿造微生物学与应用酶学研究室菌种库。

1.1.2 试剂

面粉、麸皮、黄豆,市售;阿魏酸、四乙基愈创木酚、天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸,百灵威科技公司;组胺、乳酸、乙酸、葡萄糖、甲酸,美国sigma公司;氯化钠、三氯乙酸、氢氧化钠、甲醛、酚酞、邻苯二甲酸氢钾、无水乙醇、乙腈、甲醇、硫酸,国药集团化学试剂有限公司;细菌DNA提取试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.1.3 培养基

改良MRS液体培养基,青岛海博生物科技公司,按说明使用,并添加8 g/100 mL NaCl,自然pH。

改良MRS固体培养基:同改良MRS液体培养基配制方法,再加入2%(质量分数)的琼脂粉。

发酵培养基(g/100 mL):MRS培养基53,NaCl 8,阿魏酸0.1,自然pH。

种曲培养基:按照m(麸皮)∶m(面粉)=7∶3的比例在250 mL三角瓶中加入20 g过10目筛的干料,并加入干料量70%(质量分数)的水,拌匀。

以上培养基均在121 ℃灭菌20 min。

1.1.4 仪器与设备

电子分析天平、pH计,Mettler Toledo公司;PCR仪,美国Bio-Rad公司;高压湿热自动蒸汽灭菌锅,Tomy公司;超净工作台,苏州净化设备有限公司;培养箱,上海森信实验仪器有限公司;高速离心机,Eppendorf公司;CytationTM3多功能酶标仪,BioTek公司;BX51光学显微镜,Olympus公司;超高效液相色谱仪,美国Waters公司;气相质谱仪、高效液相色谱,安捷伦科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 嗜盐四联球菌的获取

无菌条件下取适量酱醪,溶于无菌水中,振荡均匀,使用无菌生理盐水进行稀释,取不同稀释梯度涂布于改良MRS固体培养基中,30 ℃厌氧静置培养7 d,观察菌株形态。挑取单菌落于改良MRS液体培养基中,30 ℃静置培养48 h,甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 菌株的鉴定

a)形态观察:经过发酵实验筛选的目标菌株,将其菌悬液梯度稀释后涂布于MRS平板培养基,对其进行细胞观察及菌落形态观察。

b)分子生物学鉴定:使用细菌基因组提取试剂盒对菌株基因组进行提取,使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对其16S rRNA进行PCR扩增[12],PCR产物送至上海生工生物公司进行测序,测序结果使用NCBI上Blast工具进行比对,鉴定菌株。下载四联球菌同属其他模式菌株的16S rRNA序列,采用MEGA 7.0软件中的邻接(neighbor joining, NJ)法构建系统发育树。

1.2.3 高产四乙基愈创木酚菌株的筛选

将初筛所得嗜盐四联球菌活化为种子液,按3%比例接种至发酵培养基,30 ℃厌氧静置培养10 d,结束后采用0.22 μm水系滤膜过滤发酵上清液,超高效液相色谱(ultra-performance liquid chromatography, UPLC)检测发酵液中四乙基愈创木酚含量,筛选出高产菌株。

UPLC条件:色谱柱ACQUITY UPLC®HSS T3(1.8 μm×2.1 mm×150 mm);流动相:A(0.1%甲酸水),B(甲醇);洗脱程序:0～8 min,100%～48% A;8～10 min,48% A;10～15 min,48%～30% A;15～18 min,30%～100% A;流速为0.3 mL/min;检测波长280 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL[13]。

制定标准曲线:取标准品阿魏酸、四乙基愈创木酚,溶于甲醇配制质量浓度为100 mg/L的混合标准溶液,依次梯度稀释为2.5、12.5、25、50、100 mg/L。以标准溶液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制定标准曲线,建立线性方程[14]。

1.2.4 菌株生理特征

a)菌株主体代谢产物检测:将菌株活化为种子液,按3%接种量接种于改良MRS培养基中,30 ℃厌氧发酵10 d,每隔2 d取样,结束后采用0.22 μm水系滤膜过滤发酵上清液,HPLC检测发酵液中主要代谢产物含量,方法参考文献[15]。

b)氨基酸检测:使用含有0.3%(质量分数)天冬氨酸的MRS培养基,按3%接种量接种,30 ℃培养7 d,取样使用三氯乙酸处理后采用0.22 μm水系滤膜过滤发酵上清液,采用HPLC在线衍生进行检测。

c)组胺检测:使用含有0.1%(质量分数)组氨酸的MRS培养基,按3%接种量接种,30 ℃培养7 d,取样使用三氯乙酸处理后采用0.22 μm水系滤膜过滤发酵上清液,衍生后使用UPLC进行检测。

d)菌株生长曲线测定:使用含6%(质量分数)NaCl的MRS培养基,调节pH值到6.0,按3%接种量接入种子液进行培养,培养时间为72 h,每隔8 h取样,检测OD600值。

e)菌株在不同pH及盐度下生长情况:将菌株活化为种子液,按3%接种量接种到含6%、10%、15%、20%(质量分数)NaCl和pH 3.0、4.0、5.0、6.0的MRS培养基中,30 ℃厌氧静置培养72 h,检测发酵结束时OD600值。

1.2.5 高盐稀态酱油发酵工艺

a)种曲制备:将平板培养菌种的孢子用接种针接入种曲培养基,摇匀后30 ℃培养4 d,每日搅拌使曲料松散[16]。

b)大曲制备:大豆用自来水冲洗3次除杂,1.5倍温水浸泡8 h,沥干水分。121 ℃灭菌15 min,冷却至室温。将大豆、面粉和种曲进行混合,置于恒温恒湿条件下培养,及时翻曲,制曲48 h,待曲料表面布满黄色菌丝体,即可出曲。

c)发酵工艺:将大曲与20% NaCl的盐水按质量比1∶2的比例混合。将混合好的曲料加入含0.1%阿魏酸的500 mL瓶子中,将嗜盐四联球菌活化为种子液,离心收集菌体,使用生理盐水悬浮,按107CFU/g 接种,30 ℃发酵40 d,每隔10 d取样。

1.2.6 理化指标检测

pH使用pH计检测。总酸和氨基酸态氮检测参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》方法。游离氨基酸测定具体操作参考已有研究[17],使用氨基酸分析仪进行检测。挥发性化合物采用固相微萃取联合气质联用技术(phase microextraction-mass spectrometry coupled with gas chromatography-mass spectrometry, SPME-GC-MS)进行测定,详细处理办法参照郑鹏飞等[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 高产四乙基愈创木酚菌株的筛选

耐盐乳酸菌可以在含5%～25%(质量分数)NaCl的厌氧或微耗氧环境生长,最适生长温度为30 ℃[19],通常呈现白色、表面光滑的圆形菌落形态,为尽可能提高所选耐盐乳酸菌的菌株多样性,本研究以我国华东、华南、华中、华北四区域中的10家高盐发酵调味品公司的高盐发酵样品(包括酱醪、鱼酱醪等)为筛选源,在含有10%(质量分数)NaCl的MRS培养基,置于30 ℃的厌氧环境中进行耐盐乳酸菌的筛选。

对上述高盐发酵样品进行梯度稀释涂布平板,分别静置培养3、5、7 d后,通过初步的形态观察,总共随机挑选出350株具有乳酸菌形态特征的菌落。生长性能良好是工业菌种的前提,本研究首先根据培养液菌株生长情况,从中挑选出90株长势较好的菌株,并进行进一步纯化培养。将纯化菌种转接至含0.1%(质量分数)阿魏酸的发酵培养基培养8 d,使用UPLC检测各发酵液中的四乙基愈创木酚,如图1所示,菌株LBM 20027展现出突出的四乙基愈创木酚合成能力,含量达到26.8 mg/L。与之相比,嗜盐四联球菌模式菌株DSM 20339的产量仅为4.2 mg/L,由此可见耐盐乳酸菌LBM 20027具有较优的四乙基愈创木酚合成能力。因此使用菌株LBM 20027进行后续研究。

图1 不同乳酸菌株发酵液中四乙基愈创木酚含量Fig.1 4-Ethylguaiacol concentration in fermentation broth of different lactic acid bacteria strains

2.2 菌株LBM 20027的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

如图2-a所示,菌株LBM 20027菌落形态呈现为乳白色,观察其边缘比较规则表面平滑,显示为圆形菌落。在光学显微镜视野下,菌株LBM 20027多呈四联球型,也有细胞成簇聚集,排列方式多种多样(图2-b)。在高精度的扫描电子显微镜视野下,高产四乙基愈创木酚的菌株LBM 20027呈典型的成对或四联球形态(图2-c)。

a-菌落形态;b-显微镜下形态;c-电镜下形态;d-基于16S rDNA的系统发育树图2 菌株LBM 20027形态特征及系统发育树Fig.2 Morphological characteristics and phylogenetic tree of strain LBM 20027

2.2.2 分子生物学鉴定

使用PCR扩增16S rDNA序列,对高产四乙基愈创木酚菌株LBM 20027进行分子生物学鉴定。测序后获得基因序列,将其于Genebank数据库进行 BLAST 比对,比对结果表明该菌株与四联球菌属(Tetragenococcus)的几个菌种具有较高的同源性,可认定其为四联球菌属。通过多序列同源性分析,使用MEGA X 7.0的NJ法构建菌株间系统发育树如图2-d所示,结果表明菌株LBM 20027与嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)的亲缘关系最近。根据分子生物学鉴定菌株LBM 20027属于嗜盐四联球菌。而嗜盐四联球菌作为酱油发酵中的主体乳酸菌,LBM 20027有潜力更好的在酱油发酵环境下生长,同时其高产四乙基愈创木酚的能力可能有助于酱油风味的提升。

2.3 菌株的发酵性能

菌株的发酵性能,包括生长速率、耐酸耐盐性能等,是评判该菌株能否在食品发酵过程中成功定植并发挥风味增强作用的关键因素之一。另外,对于食品发酵行业来说,菌种安全性是其能否用于食品发酵的重要前提。嗜盐四联球菌已在日本酱油生产中有半个世纪的应用历史,暗示该菌种可能具有食品安全的特性。然而,嗜盐四联球菌并非在我国《可用于食品的菌种名单》中,因此,本研究对筛选得到的嗜盐四联球菌LBM 20027进行了必要的菌种安全及发酵性能测试。

2.3.1 菌株生长曲线

由图3-a可知,菌株LBM 20027在培养初期(0～40 h)生长较慢,为生长迟缓期;而在40～48 h生长速率明显增加,此时为对数增长期;48 h后生长速率逐渐变慢,到56 h进入稳定期,此后OD600值再无明显变化。

a-生长曲线;b-基础代谢;c-丙氨酸;d-组胺;e-耐酸性;d-耐盐性图3 菌株LBM 20027的生长特性Fig.3 Growth characteristics of strain LBM 20027

2.3.2 菌株主体代谢产物

通过HPLC检测菌株LBM 20027发酵过程中葡萄糖消耗以及主体代谢产物生成情况,结果如图3-b所示。可以看出,菌株LBM 20027主要代谢葡萄糖,产生乳酸和乙酸,表现为兼性乳酸发酵形式。在发酵前4 d,葡萄糖被大量消耗,同时迅速生成乳酸和乙酸,第4天后,葡萄糖消耗速率变慢,乳酸和乙酸的生成也变慢,趋于平稳,发酵第10天,生成3.35 g/L乳酸和1.14 g/L乙酸。

2.3.3 菌株氨基酸转化

嗜盐四联球菌可能具有将天冬氨酸转化为甜味氨基酸——丙氨酸的能力,而丙氨酸呈现甜味,能丰富酱油的口感。因此,是否能将天冬氨酸有效转化为丙氨酸是嗜盐四联球菌性能的重要指标之一。本研究对高产四乙基愈创木酚的菌种LBM 20027和模式菌株DSM 20339的天冬氨酸转化能力进行检测。结果如图3-c所示,在含有0.3%天冬氨酸的MRS培养基培养7 d后,LBM 20027生成了28 mg/L的丙氨酸,而模式菌株DSM 20339仅生成了10 mg/L的丙氨酸。因此,LBM 20027不仅在风味化合物4-乙基愈创木酚合成方面具有优良特性,其转化天冬氨酸为丙氨酸的能力很强,是有潜力的工程菌种。

2.3.4 关于生物胺产生的安全性分析

已有报道显示,嗜盐四联球菌在合成组胺时具有菌株水平特异性,即有些嗜盐四联球菌会利用组氨酸合成对人体健康有害的组胺,而有些菌株不具有上述催化反应。本研究通过液相检测组胺浓度,从而对菌株LBM 20027的组胺合成能力进行检测。结果如图3-d所示,以具有组胺合成能力的嗜盐四联球菌LBM 20159作为对照,经过7 d发酵,组胺产生菌LBM 20159生成组胺602.5 mg/L,而LBM 20027无法合成组胺。因此,LBM 20027在组胺形成方面具有生物安全性。

2.3.5 菌株耐受性检测

本研究对菌株LBM 20027耐受酸性及NaCl能力进行检测。结果如图3-e、图3-f所示,LBM 20027在pH 6.0～7.0时具有良好的生长性能,可判定该菌株的最适pH值为6.0～7.0,在pH 5.0以下生长性能较弱。相较于模式菌株DSM 20339,菌株LBM 20027在酸性环境下显示出更好的耐受性。菌株的耐盐能力如图3-f所示,可以看出菌株的生长能力随着NaCl浓度的升高而降低,在6%(质量分数)NaCl条件下,展现出最佳生长性能,与模式菌株DSM 20339相比,生长能力略高。

2.4 模拟发酵

2.4.1 基本理化特征

如上所示,菌株LBM 20027在四乙基愈创木酚合成及天冬氨酸转化方面具有显著优势。本研究将该菌株作为模拟酱油起始发酵菌剂,来探究优质菌剂添加对酱油品质的影响。本研究通过模拟酱油发酵实验,在发酵第0天添加106CFU/mL的菌株LBM 20027,在发酵0、10、20、30、40 d取样,对模拟高盐稀态酱油发酵过程中的基本理化指标pH、总酸、氨基酸态氮以及四乙基愈创木酚进行检测,来检验LBM 20027的发酵性能。

如图4所示,嗜盐四联球菌作为起始发酵菌剂被加入酱油发酵体系中后,pH略有下降(图4-a),在发酵前10 d,酱醪pH迅速降低,10 d后pH降低速度变缓,到20 d趋于稳定,此时pH值为4.4;总酸变化如图4-b所示,在发酵前10 d,快速提升,后续趋于稳定,达到11 g/100 mL,相较于空白提升了22.2%。氨基酸态氮变化如图4-c所示,前10 d增长迅速,而10 d以后趋于稳定,发酵结束时达到0.5 g/100 mL,比空白组略高。

a-pH变化;b-总酸变化;c-氨基酸态氮变化;d-四乙基愈创木酚变化图4 模拟发酵过程理化特征及风味化合物变化Fig.4 Physicochemical characteristics and changes of flavor compounds during simulated fermentation

2.4.2 模拟发酵过程中四乙基愈创木酚变化

在模拟酱油发酵过程中,对四乙基愈创木酚的含量进行追踪,结果如图4-d所示。四乙基愈创木酚在酱油模拟发酵过程前20 d呈现快速增长的趋势,20 d后增长趋于平稳,暗示嗜盐四联球菌LBM 20027由于具有良好的耐盐耐酸性能,在发酵前20 d成功定植并发挥风味物质合成能力。如图4-d所示,在发酵40 d时,与添加模式菌株DSM 20339和不接发酵剂的空白组比较,接种嗜盐四联球菌LBM 20027的模拟酱油发酵样品中四乙基愈创木酚含量分别是它们的1.44和3.34倍。

目前国际上已报道的具有高产四乙基愈创木酚能力的微生物主要以芽孢杆菌和酵母菌为主。郭明威等[14]报道了一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),其四乙基愈创木酚产量达到29 mg/L;王少磊等[20]报道了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens),其四乙基愈创木酚产量达到33 mg/L;邹谋勇等[21]报道了一株拟威克酵母(Wickerhamiellaversatilis),其四乙基愈创木酚产量达到630 mg/L。如上四乙基愈创木酚高产菌种有潜力高效提升酱油中四乙基愈创木酚含量。然而,酱油的浓郁风味来源于包括四乙基愈创木酚在内的多种风味成分而非单一成分。本研究筛选的高产四乙基愈创木酚的菌种为嗜盐四联球菌,该菌种为酱油酿造过程中的优势微生物,贯穿整个酱油发酵周期,且能发酵生成多种风味成分或风味物质前体,已作为一种优良的起始发酵剂用于在日韩高盐发酵食品生产中。如图1及图4-d所示,相比于嗜盐四联球菌的模式菌株DSM 20339,嗜盐四联球菌LBM 20027在单菌发酵及模拟酱油发酵中均展现了高效的四乙基愈创木酚合成能力。

2.4.3 挥发性物质

为了验证接种嗜盐四联球菌LBM 20027对酱油发酵过程整体挥发性物质的影响,本研究对发酵样品进行了GC-MS检测。结果如图5所示,在接种样品组中,发现酯类和酸类化合物含量明显高于空白组,而高浓度的酸类物质有助于浓郁的酯香形成,如乙酸乙酯、己酸乙酯、醋酸、丁酸、异戊酸等,这些酯类化合物赋予酱油强烈的果香和酒香,同时愈创木酚、四乙基愈创木酚、四乙烯基愈创木酚的含量接种LBM 20027的组别高于接种DSM 20339的样品组,赋予酱油其独特的酱香特征。但空白组中部分醇类化合物高于接种组,如乙醇、异丁醇、正己醇、3-甲硫基丙醇等。接种嗜盐四联球菌可以有效提高包括四乙基愈创木酚在内的各种风味物质含量,且接种LBM 20027的效果更为明显。

图5 模拟发酵过程挥发性化合物热图Fig.5 Heat map of volatile compounds in simulated fermentation process

3 结论

本研究对高盐发酵食品的酱醪进行分离筛选,在高盐环境下筛选出一株具有高四乙基愈创木酚转化能力的耐盐乳酸菌LBM 20027,通过对其形态和分子生物学鉴定,发现该菌LBM 20027为嗜盐四联球菌。将该菌株LBM 20027与嗜盐四联球菌模式菌株DSM 20339相比,LBM 20027的耐酸和耐盐能力更加出色,不产生组胺,具有更好的四乙基愈创木酚转化能力和天冬氨酸转化能力。将菌株应用于高盐稀态酱油模拟发酵,结果显示,在模拟体系中菌株LBM 20027也具有更好的四乙基愈创木酚产生能力,上述结果显示出该菌株改善酱油风味的巨大潜力。