沈彩奕,黎玉婷,刘晓敏,王溢华,冯光志,石 玉

(武汉设计工程学院食品与生物科技学院,湖北武汉 430205)

硒是人体必需微量元素,硒在人体中可编码 25 种硒蛋白,具有多种生化功能,缺硒可导致心脏功能障碍、炎症、肝病甚至癌症等 40 种生理疾病[1-2]。然而,根据中国营养学会发表的资料显示,在我国许多地区人体硒元素存在不同程度的缺乏,长期摄入量的不足,必将耗尽体内的储存,从而影响身体健康,甚至导致疾病的发生[3]。为了满足人们对硒的需求,近些年科研工作者致力于开发富硒产品,包括富硒酵母、富硒茶、富硒藻类、富硒蔬菜、富硒水果和富硒大米等,取得了一定的效益,但远不能满足市场需求。食用菌具有很高的营养价值和药用价值,深受广大消费者青睐,食用菌产业经过多年的发展,已成为我国产业中仅次于粮、油、蔬、果的第五大产业,食用菌产品也成为我国国民餐桌上习以为常的美味佳肴[4-8]。平菇(Pleurotusostreatus) 又称糙皮侧耳,是我国栽培最为广泛的食用菌[9],研究表明,平菇具有吸收和富集金属元素的生物学特性[10-13],平菇对有益微量元素的富集,可以促进食用菌的生长,增加食用菌营养价值与功能活性成分[14-15]。同时,以游离态存在的硒,具有一定毒性,也不易被人体吸收,通过平菇的富集作用,将无机形态的硒,与平菇体内的生物分子结合,形成易于人体吸收且毒性小的有机硒,更有利于硒的免疫功能和平菇保健功能的发挥。

平菇在生长发育过程中产生胞外酶,胞外酶可以分解培养料使多糖、蛋白质、核酸等天然高聚物裂解成食用菌菌丝和子实体便于吸收的小分子物质,为平菇菌丝生长、原基形成、子实体生长提供营养物质[16],平菇胞外酶活性与平菇的生长发育息息相关。有益元素在平菇生长发育过程中发挥重要作用,显著影响平菇的菌丝生长,以及营养价值与功能活性成分[17]。同时,有益元素还会一定程度的在平菇子实体中富集,进而提高平菇品质。然而,金属元素的过度使用,又会对平菇的生长发育产生抑制,甚至造成平菇的重金属污染。为此,笔者通过袋料栽培研究不同浓度硒对平菇生长和胞外酶活性的影响,确定平菇栽培最适硒浓度,以期为进一步开发富硒食用菌产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器供试平菇菌种保藏于武汉设计工程学院食品与生物科技学院实验教学中心。

亚硒酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、可溶性淀粉、滤纸、葡萄糖、木糖、3,5-二硝基水杨酸( DNS) 、酒石酸钾钠、结晶酚、无水亚硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、一水合柠檬酸、二水合柠檬酸三钠,均购自国药集团化学试剂有限公司,木聚糖购自sigma公司。

AL104电子天平、722型紫外可见分光光度计、SW-CJ-ZG超净工作台、BXM-30R立式压力蒸汽灭菌器、TG16-WS 台式高速冷冻离心机、HH-S6 恒温水浴锅。

1.2 培养基斜面培养基为PDA固体培养基。基础袋料培养基为玉米芯58%,麦麸20%,秸秆20%,石膏1%,石灰1%,与水以质量比1∶1.2混合均匀,分装于培养袋中,每袋装样量180 g。

1.3 试验方法

1.3.1富硒平菇的接种栽培。在基础袋料培养基中添加亚硒酸钠,使硒终浓度分别为0、200、300、400 mg/kg,在无菌条件下,将在斜面培养基中活化好的平菇菌丝以1 cm2菌块大小接种到基础袋料培养基中,每个浓度设3 个平行。

1.3.2粗酶液的制备。在平菇生长的7个时期(菌丝半袋、菌丝满袋、满袋后熟、菌芽期、伸长期、成熟期、采后,编号依次为1～7),无菌条件下,分别从培养袋中称取1 g菌丝混合后置于研钵中,加入10 mL去离子水冰上研磨,然后转移至离心管中,再量取5 mL去离子水洗涤研钵,一并转移至离心管中,4 ℃、8 000 r/min离心10 min,离心后的上清液即为粗酶液。

1.4 测定项目与方法

1.4.1羧甲基纤维素钠酶活(CMCase)的测定。取200 μL粗酶液与800 μL底物(1% 羧甲基纤维素钠)混匀后35 ℃水浴30 min,立即加入1.5 mL DNS试剂,沸水浴5 min,冷却后,蒸馏水定容至10 mL,在 540 nm下测定含糖量,以沸水灭活的粗酶液作为对照,设3次重复。酶活定义为1 min转化葡萄糖的毫克数。

1.4.2木聚糖酶活的测定。取200 μL粗酶液与800 μL底物(1% 木聚糖)反应,方法参照“1.4.1”。酶活定义为1 min 转化木糖的毫克数。

1.4.3淀粉酶活的测定。取200 μL粗酶液与800 μL底物(1% 可溶性淀粉)反应,方法参照“1.4.1”。酶活定义为1 min转化葡萄糖的毫克数。

1.4.4滤纸酶活的测定。取200 μL粗酶液、800 μL缓冲液、3片直径1 cm的小滤纸片混匀后反应,方法参照“1.4.1”。酶活定义为1 min转化葡萄糖的毫克数。

2 结果与分析

2.1 硒对平菇生长发育的影响不同质量浓度硒对平菇生长发育有显著影响。随着硒质量浓度的增加,菌丝生长速度加快,说明添加适量硒会促进平菇菌丝生长。当硒质量浓度为 300 mg/kg 时,平菇菌丝生长最快。随着硒质量浓度的进一步增大,菌丝生长速度又逐渐下降。从菌丝形态、生长势和满袋时间看,添加300 mg/kg 硒处理的平菇菌丝洁白、浓密、粗壮且平菇菌丝提前长满菌袋。

2.2 硒对CMC酶分泌的影响从图1可以看出,在平菇生长发育的前4个时期,不同浓度的硒添加量对平菇胞外羧甲基纤维素酶活性的影响较小,在子实体伸长期后,不同硒添加量的胞外羧甲基纤维素酶活性迅速提高,且在子实体成熟期达到峰值,活性大小表现为300 mg/kg Se>400 mg/kg Se>200 mg/kg Se>0 mg/kg Se,分别为13.81、12.73、11.35、10.94 U/g,子实体采摘后纤维素酶活性呈下降趋势。

图1 不同硒添加量平菇纤维素酶活性变化Fig.1 Changes of CMCase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.3 硒对木聚糖酶分泌的影响从图2可以看出,在平菇菌丝生长阶段,不同硒添加量培养料的木聚糖酶活性基本保持不变,菌芽期到子实体成熟期,酶活大幅度提高,在子实体成熟期,木聚糖酶活性最高的是300 mg/kg 硒培养料,酶活性为15.84 U/g,其余由大到小依次为200 mg/kg Se>0 mg/kg Se>400 mg/kg Se,最大值分别为14.68、13.11、11.46 U/g,子实体采摘后降低。

图2 不同硒添加量平菇木聚糖酶活性变化Fig.2 Changes of xylanase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.4 硒对滤纸酶分泌的影响由图3可知,平菇生长的菌芽期以前,不同硒添加量的平菇胞外滤纸酶均维持较低的活性,菌芽期后开始逐渐升高,在子实体成熟前,不同硒添加量的胞外滤纸酶活性快速提高,成熟期均达到最大,其中活性最高的是300 mg/kg Se,为5.98 U/g,其余由大到小依次为200 mg/kg Se >0 mg/kg Se >400 mg/kg Se,最大值分别为5.30、4.57、2.62 U/g。子实体采摘后迅速降低。

图3 不同硒添加量平菇滤纸酶活性变化Fig.3 Changes of FPase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

2.5 硒对淀粉酶分泌的影响由图4可知,在平菇菌丝生长时期,不同硒添加量的平菇胞外淀粉酶均维持较低的活性,进入后熟期后酶活性开始迅速提高,在子实体成熟期胞外淀粉酶活性最高,其中300 mg/kg Se 培养料活性最大值为14.47 U/g,其余由大到小依次为200 mg/kg Se >0 mg/kg Se >400 mg/kg Se,最大值分别为12.79、12.19、9.12 U/g,采摘子实体后开始逐渐下降。

图4 不同硒添加量平菇淀粉酶活性变化Fig.4 Changes of amylase activity in Pleurotus ostreatus under different selenium additions

3 讨论

食用菌胞外酶活性反映菌株对基质的降解能力,影响食用菌的生长周期。早在1977年,Wood等[18]研究发现双孢菇的产量与纤维素酶的活性密切相关,随后,Claydon 等[19]也证实了这个结论。目前,一些学者对这些胞外酶与食用菌生长发育的关系进行了研究。主要包括2个方面:一是培养基质对食用菌胞外酶活性的影响,另一个方面是金属元素对食用菌胞外酶活性的影响。关于培养基质方面的研究较多,高芮等[20]研究了工业生产上常用的5种配方对金顶侧耳生育期间的营养利用及胞外酶活性的影响,结果表明,不同配方培养料中菌丝对营养物质的降解利用能力不同。贺春玲等[21]利用葡萄木屑代替常用配方木屑栽培香菇,筛选出葡萄木屑栽培香菇高效配方 D1,配方 D1香菇子实体农艺性状优于对照,但配方 D1 转色及采收时间比对照晚 2 d 左右,且随着葡萄木屑添加量的增加,香菇菌丝漆酶活性呈逐渐降低趋势。可见,食用菌培养基质对食用菌的胞外酶分泌以及食用菌的生长发育有较大影响,选择适当的培养基质,既可以降低成本,也可以调节食用菌的胞外酶活性,改善食用菌品质,缩短食用菌的培养周期。随着对食用菌研究的不断深入,许多科研工作者发现,金属元素在食用菌生长发育过程中发挥着重要作用,主要包括两类金属元素:一类是食用菌生长以及人体所必需的某些金属元素,如钾、钙、锌、硒、铁、碘等元素,它们对于食用菌的生长发育具有一定的促进作用,另一类是对食用菌生长以及人体有害的元素,主要有铅、砷、镉、汞等,这些金属可能带来食用菌产品的质量安全问题。目前关于这些有害元素的报道较多,熊晓斌等[22]研究了铅、砷、镉、汞对食用菌菌丝生长的影响,结果表明培养料添加重金属质量浓度小于 1 mg/kg时,菌丝生长速度变慢,重金属质量浓度大于 1 mg/kg时,会明显抑制菌丝的生长。对于有害金属元素的研究主要集中于重金属对食用菌的富集而引起的食用菌产品污染。随着人们对健康饮食的日益重视,富硒富锌食品备受人们推崇,硒、锌等有益元素对食用菌生长发育的研究逐渐增多,杨慧等[23]采用液体摇瓶培养方法,比较了铁、锌和钙离子对食用菌生长的影响,表明铁、锌和钙离子可以在香菇、金针菇和刺芹侧耳菌丝中富集,适当浓度的金属离子能够促进菌丝生长。赵金凤等[24]通过含有不同硒浓度液体培养基培养茶树菇,研究了菌丝胞外酶的活性变化,表明硒对菌丝胞外酶活性有一定的影响,添加适宜浓度的硒对茶树菇菌丝胞外酶活性均有促进作用。该研究通过添加不同浓度硒进行袋料栽培平菇,考察菌体生长及培养基中纤维素酶、木聚糖酶、滤纸酶、淀粉酶活性的变化,为开发富硒平菇和工厂化富硒栽培提供最直接的数据。

富硒食用菌产品开发的关键在于控制金属元素含量。适量的金属离子对提高食用菌产量、改善食用菌品质、开发新的食用菌产品、推动食用菌产业发展,都具有积极意义,但金属元素的过度使用,又会抑制食用菌的生长,甚至造成食用菌的重金属污染,对人体健康产生潜在危害。该研究通过向秸秆基质中添加不同浓度的硒,研究硒对平菇生长和胞外酶分泌的影响,发现硒能够促进平菇菌丝生长、缩短出菇时间。不同质量浓度硒对平菇分泌的同种胞外酶,其活性在各生长发育阶段不同,但不影响平菇胞外酶活性的变化趋势。不同质量浓度硒对平菇胞外酶活性有较大影响,该研究中添加的300 mg/kg 硒,有效促进了平菇胞外酶的分泌,促进了平菇菌丝生长,缩短了平菇生产周期,对平菇的富硒栽培具有一定的指导意义。