赫英姿 于庭洪 贾 姝 赵 翀 左玲玲 宋 策

(辽宁省蚕业科学研究所,辽宁凤城 118100)

柞蚕微粒子病是柞蚕的主要传染性病害之一,用光学显微镜检查微孢子虫仍然是生产上较为直接的诊断方法。针对我国人口老龄化导致用工荒加剧和目前柞蚕繁种地区北移使得种茧微孢子虫感染比例降低的现状[1-2],柞蚕集团母蛾镜检提上日程。不同于桑蚕集团母蛾镜检,桑蚕滞育后为集团母蛾镜检预留了时间,而柞蚕集团母蛾镜检需要当日完成。为了提高检出率,对研磨液进行离心处理,而离心后镜检检出率与不离心相比有无差别,尤其是与纯净孢子液(清水稀释液)相比,脂肪细胞的大量存在是否影响微孢子虫的检出率,是此项工作需要探讨的问题。为此进行了以下技术处理方法试验。

1 材料与方法

1.1 供试材料

柞蚕微孢子虫由患病柞蚕母蛾中分离提取,制成纯孢子悬浮液,计数后贮存于4 ℃冰箱中备用,常规镜检无锈母蛾若干。

普通血球计数板一块;TD-4低速台式离心机一台,由江阴保利器械有限公司生产。

1.2 试验方法

镜检方法分为常规镜检和离心镜检,以上检查均是在光学显微镜(640倍)下观察、统计;离心采用3 000 r/min转3 min。

稀释液分为清水、90%清水+10%蛾脂肪(水和脂肪按照体积比混合)两种。

用血球计数板测出孢子悬浮液浓度为1×108个/mL,根据经验配制了1×106个/mL、1×105个/mL、9×104个/mL、1×104个/mL、1×103个/mL、1×102个/mL几个浓度的溶液,镜检每片取样量为20 μL。

1.3 调查方法

镜检结果分为5个视野可见微孢子虫和6-10个视野可见微孢子虫两种,每处理3次重复。每次镜检凡看到微孢子虫无论数量多少记为1、未见到微孢子虫记为0,以几率值计算。

2 结果与分析

2.1 常规镜检

2.1.1 稀释液为清水的各个浓度微孢子虫检出率

当稀释液为清水时,视野里比较纯净,微孢子虫形态易于识别,只要有孢子出现就能看到,不容易漏检。缺点是捕捉视野比较困难。1×105个/mL浓度是个比较临界的浓度,前5个视野能检出孢子是生产上十分必要的环节,当低于这个浓度时,极易造成漏检。具体见表1。

表1 稀释液为清水时微孢子虫检出情况

2.1.2 稀释液为90%清水+10%蛾脂肪各个浓度微孢子虫检出率

根据表1结果,在稀释液中加入10%蛾脂肪,有了脂肪球,视野捕捉容易,但是视野清晰度会变差,在检出临界点浓度1×105个/mL上,即每个视野能见到一个孢子,脂肪球等的干扰会影响检出率。具体如表2。

表2 稀释液为90%清水+10%蛾脂肪时微孢子虫检出情况

2.2 离心处理后镜检

2.2.1 稀释液为清水时离心沉淀各个浓度微孢子虫检出率

将含有一定量微孢子虫的液体离心沉淀,当稀释液为清水时,1×104个/mL处理浓度,离心沉淀3个重复前5个视野均检出孢子;1×103个/mL处理中有两个重复前5个视野检出孢子,另外一个重复中前10个视野检出孢子;1×102个/mL处理全部视野检不出孢子。具体见表3。

表3 清水稀释液离心沉淀后微孢子虫检出情况

表3结果表明,当孢子浓度低至1×104/(个/mL)且稀释液为清水时,通过离心富集的方法,可以很容易检出孢子,但当孢子浓度进一步低时,达到100个/mL,离心仍未检测出孢子。

2.2.2 稀释液为90%清水+10%蛾脂肪离心沉淀各个浓度微孢子虫检出率

当稀释液为清水+脂肪时,离心沉淀由于脂肪球的密集干扰,镜下视野观察较清水稀释液困难,1×104/(个/mL)、1×103/(个/mL)都仅有1个重复前5个视野检出孢子,1个重复10个视野检出孢子,1个重复始终没检出孢子;但同时由于有脂肪球的指示作用,捕捉视野较清水稀释液容易,因此1×102/(个/mL)处理中1个重复前5个视野检出孢子,但另外两个重复始终检不出孢子。具体见表4。

表4 稀释液为90%清水+10%蛾脂肪离心沉淀后微孢子虫检出情况

3 讨 论

3.1 柞蚕微粒子病由于胚种传染的特点使其成为生产中毁灭性的传染性病害,为避免其危害,研发出了免疫学和分子生物学等具有很高的灵敏度检测技术,即使样品中微孢子虫浓度为1×102个/mL,检出率仍达到90%,但当样品为感染微粒子病病蛾时,这些检测技术的灵敏度大幅下降[3]。显微镜检测母蛾技术在孢子检出率上要求样品中孢子达到一定浓度方可检出,刘仁华等人[4]指出1×104个/mL是集团母蛾镜检是否检出的浓度临界值,低于这个浓度检出概率为0～1,高于这个浓度检出概率为1。那么,在柞蚕生产中,新鲜母蛾脂肪干扰前提下,集团母蛾镜检的检出率怎样,是否还遵循上面的规律,还需要试验验证。

3.2 本次试验通过比较稀释液中有无鲜蛾脂肪球,发现鲜蛾脂肪球的存在会影响孢子的检出率。光学显微镜下当孢子浓度为1×105个/mL左右时,在清水稀释液纯净孢子中,10个视野3个重复均检出孢子,加入10%蛾脂肪后,检出率会变差,全部10个视野有一个重复始终未检出孢子;当孢子浓度为9×104个/mL时,稀释液无论有无脂肪球干扰,都只有一个重复全部10个视野观察到孢子,且数量仅为1个;当孢子浓度为1×104个/mL时,稀释液无论有无脂肪球,都观察不到孢子。通过离心极大提高孢子的检出率,即使孢子浓度低至1×103个/mL时,清水稀释液全部10个视野均能检出孢子,当加入了蛾脂肪球后,离心处理后微孢子虫检出率也有所下降,前5个视野检出概率较清水低,且全部10个视野有一个重复始终检不出孢子。

3.3 柞蚕集团母蛾镜检是微粒子病检验检疫技术发展的必然趋势,本次集团母蛾检验试验过程中发现:与传统的显微镜母蛾检查相比,样品制作要求蘸取沉淀的量要适当,且要一个样品制作多个片子,逐渐稀释脂肪利于观察;显微镜检查时观测的视野数量要多,细致程度要高,至少观察10个视野,不能一带而过。这一点与家蚕集团母蛾镜检的要求相一致[5]。

3.4 家蚕集团检验中为提高检出率,磨蛾通常使用0.5%K2CO3作为研磨液[6],秦利等指出在卵及蚁蚕整体取样检验时,可加入1%KOH或NaOH研磨[7]制成临时标本进行检查。生产中柞蚕集团研磨是否应使用碱液作为研磨液,以及使用的浓度和方法,今后还需要进一步试验。