惠红岩，周芳，周祥

新乡医学院第一附属医院临床药学学部1、神经外科二病区2，河南 卫辉 453100

卒中分为出血性卒中和缺血性卒中，后者是主要的卒中类型(占60%～80%)。脑血疏口服液说明书推荐适应证中仅有出血性中风，无缺血性中风。齐江彤等[1]研究发现，脑血疏口服液对缺血性卒中的脑血流动力学、神经功能、生活质量、脑源性神经营养因子、凝血功能均有改善作用；吴江莹等[2]发现，脑血疏口服液对急性缺血性脑卒中患者的血脂、纤维蛋白原(FIB)、C 反应蛋白(CRP)改善显著；作用机制尚不明确。本研究采用网络药理学和分子对接技术，探讨脑血疏口服液在缺血性卒中治疗中的有效活性成分及作用机制等，为促进临床合理用药、增加缺血性卒中适应证的可能性提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 有效化学成分收集、筛选 通过TCMSP及文献收集所包含的7味中药的化学成分[3-4]，并通过口服生物利用度(oral bioavailability，OB)(OB≥30%)和类药性(drug likeness，DL)(DL≥0.18)进行筛选(水蛭除外)。

1.2 药物活性成分靶点及疾病靶点分析 通过PubChem 和SwissTarget Prediction数据库获得各成分对应的靶点信息并进行过滤；通过HERB 数据库获得水蛭素靶点基因。通过GeneCards 和DisGeNET 数据库，分别以“cerebral arterial thrombosis”、“ischemic stroke”为关键词，获得缺血性脑卒中相关的靶点基因，并进行去冗余。

1.3 “单味药-活性成分-作用靶点”网络模型的构建与分析 利用Cytoscape 软件构建“单味药-活性成分-作用靶点”网络，筛选脑血疏口服液治疗缺血性卒中的主要活性成分、作用靶点。

1.4 蛋白互作(PPI)网络的构建 将获得的作用靶点导入STRING数据库，分析结果导入Cytoscape软件。

1.5 生物功能注释与通路富集分析 利用Metascape数据库进行GO功能注释和富集分析。

1.6 有效成分-关键靶点分子对接分析 选择最重要的候选活性化合物和靶点进行分子对接：(1)使用Chemoffice 15.1软件将2D结构以最小能量转为3D结构并导出；(2)应用PyMOL2.5.1 软件，进行氢化、受体蛋白脱水等初步处理；(3)利用AutoDock Vina1.1.2软件，将蛋白受体与脑血疏口服液中的活性化合物的小分子配体对接。

2 结果

2.1 脑血疏口服液活性成分及靶点预测 得到脑血疏口服液7种单味药的潜在活性成分及123个无冗余的药物潜在靶点(除外无靶点者)，得到2 687个无冗余的缺血性脑卒中靶点。

2.2 “单味药-活性成分-作用靶点”网络模型的构建 将药物潜在靶点和疾病相关靶点匹配分析取交集、剔除重复，最终得到共有靶点67个(图1)。构建“单味药-活性成分-作用靶点”网络(图2)：将脑血疏口服液主要单味药成分、活性化合物及67个共有靶点信息导入Cytoscape 软件，得到103 个节点，195 条边，包括7 个单味药，29 个活性成分(表1)，67 个作用靶点。每个活性成分平均与6.62个作用靶点相互作用，高于平均度值的活性成分有11 个，排名前6 的是山柰酚(kaempferol)、β-胡萝卜苷(beta-daucosterol_qt)、胡萝卜苷(Daucosterol_qt)、谷甾醇(sitosterol)、β-谷甾醇(betasitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)，其度值分别为45、11、10、10、9、9；而牛膝和黄芪是度值最高的两个单味药，分别为10 和9。每个作用靶点平均与2.29 个活性成分相互作用，高于平均度值的靶点有16 个：NR1H3的互作活性成分最多，度值为11；CYP19A1、HMGCR、RORC 度值均为9；AR、CYP17A1、SREBF2 度值均为8。这些单味药和活性成分可能是脑血疏口服液治疗缺血性脑卒中中发挥重要作用的主要成分，而这些靶点可能是其主要作用靶点。

表1 脑血疏口服液7味中药的29种活性成分Table 1 29 active ingredients in Naoxueshu oral liquid of 7 traditional Chinese medicines

图1 韦恩图Figure 1 Venn diagram

图2 脑血疏口服液治疗缺血性卒中的“单味药-活性成分-作用靶点”网络Figure 2 "Single drug-active ingredient-target"network of Naoxueshu oral liquid in the treatment of ischemic stroke

2.3 共有靶点PPI网络的构建 基于STRING数据库，对67个共有靶点进行PPI分析，导入Cytoscape软件绘制网络图(图3)。剔除孤立靶点，PPI网络包含61个节点，平均度值11.31，度值大于均值的靶点22个：AKT1(48)、PTGS2 (33)、EGFR (31)、SRC (30)、ESR1 (28)、MMP9 (28)、IL2 (21)、KDR (20)、MMP2 (20)、AR (19)、PIK3R1 (19)、IGF1R (17)、GSK3B (16)、ABCB1 (15)、MET (15)、MPO (15)、PTK2 (15)、ABCG2 (14)、ESR2(14)、HSPA5 (14)、PTPN1 (14)、CYP19A1 (13)。这些靶点的相互作用可能是治疗缺血性脑卒中的关键靶点。

图3 蛋白互作网络图Figure 3 Protein interaction network diagram

2.4 分子对接 分子对接山柰酚与PPI 网络中的靶点AKT1、PTGS2、EGFR、SRC，结果发现，山柰酚与AKT1 的结合势能最低(-9.3 kcal·mol)，其次是SRC (-9.1 kcal·mol)、PTGS2 (-8.6 kcal·mol)和EGFR(-7.8 kcal·mol)，见表2。山柰酚与以上四个靶点的分子对接结果进行可视化(当结合能≤-7.00 kcal/mol时，表明配体和受体蛋白间的结合活性很强[5-6]，见图4。

表2 山柰酚与top 4靶点的分子对接Table 2 Molecular docking of kaempferol with top 4 target

图4 山柰酚与核心靶点的分子对接Figure 4 Molecular docking of kaempferol with core targets

2.5 作用靶点的功能、通路的注释与富集分析结果 对作用靶点进行功能、通路的注释与富集分析，以期揭示脑血疏口服液在缺血性卒中治疗中的可能机制，为临床合理用药提供支持。GO 注释富集共得到3 413 个条目：与分子功能(MF)相关的有313 个，与细胞组分(CC)相关的有210 个，与生物过程(BP)相关的有2 890 个。分别选择富集显著性前20 的条目进行可视化(图5A～5C)。在分子功能中，脑血疏口服液治疗缺血性卒中功能主要集中在血红素结合、四吡咯结合、铁离子结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性、氧化还原酶、单氧酶活动、丝氨酸水解酶活性、磷酸酶结合、激素结合、蛋白磷酸酶结合、胰岛素受体结合、类固醇结合、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性等(图5A)；在细胞组分中，主要集中在囊泡腔、细胞质囊泡腔、细胞膜组分、黏着斑等(图5B)；在生物过程中，主要集中在细胞对化学成分的反应、类二十糖苷代谢过程、调节体液水平、炎症反应的调节等(图5C)。KEGG 通路注释与富集共得到165 个通路，选择富集显著性前20 的通路进行可视化(图5D)，脑血疏口服液治疗缺血性卒中的相关通路主要集中在内分泌抗性、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂抗性、雌激素信号通路、卵巢类固醇合成、PI3K-Akt 信号通路等。其中，雌激素信号通路和PI3K-Akt 信号通路的通路图如图6 和图7 所示。

图5 作用靶点的功能与通路富集分析Figure 5 Target function and pathway enrichment analysis

图6 雌激素信号通路图Figure 6 Estrogen signaling pathway

图7 PI3K-Akt信号通路图Figure 7 PI3K-Akt signaling pathway

3 讨论

本研究系统分析了脑血疏口服液在缺血性脑卒中治疗中的有效活性成分，构建的“单味药-活性成分-作用靶点”网络中包括7 个单味药的29 个有效活性成分，起关键作用的单味药主要是黄芪和牛膝，关键的活性成分是山柰酚、β-胡萝卜苷等。

黄芪具有行滞通痹的作用，能补气以行血，补气以通痹，可以调节脑血管供血不足，对于痹症、中风后遗症等有一定的治疗作用。其活性成分槲皮素、山奈酚、异鼠李素、黄芪甲苷等通过作用于细胞凋亡等方面的靶点，干预细胞凋亡、内皮血管生成，激活补体等疾病代谢途径，促进神经元修复，在缺血性脑卒中的预防和治疗中，作用良好[7-8]。牛膝的功效有逐瘀通经，引血下行等，还具有对神经细胞的保护作用[9]。

黄芪、牛膝、牡丹皮、石菖蒲中均含有的山柰酚，是一种具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等作用的化合物[10-12]。山柰酚能够减轻脑卒中后的梗死面积，预防给药能有效改善缺血性脑损伤大鼠神经功能缺损，具有潜在的预防和治疗卒中的作用[13-14]。牛膝中含有β-胡萝卜苷，大黄中含有胡萝卜苷，胡萝卜苷可以上调超氧化物歧化酶(SOD2)等的mRNA 水平，还能提高HO-1 的蛋白含量[15]，进而提高氧和葡萄糖剥夺及模拟再灌注处理后的皮层神经元的存活率等，发挥神经保护作用[16-17]。本研究通过网络药理学预测的山柰酚、β-胡萝卜苷等可能的活性作用，与上述文献报道一致。

该药在缺血性卒中的治疗中，涉及多个靶点，共有靶点蛋白互作网络和“单味药-活性成分-作用靶点”网络提示，AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等靶点在缺血性卒中的预防和治疗过程中，可能发挥着重要的作用。AKT1在缺血脑复灌时，磷酸化Akt明显高表达[18]。非受体酪氨酸激酶SRC 参与多种细胞信号转导途径，包括基因转录、黏附调节、细胞增殖和血管生成等，与缺血性卒中中血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管通透性增加和小鼠永久性局灶性脑缺血后的脑损伤相关[19-20]。PTGS2能够参与介导脑缺血后的炎性反应[21]。EGFR 有助于副炎性调节异常，与心血管功能障碍和重塑、脑损伤相关[22-23]。因此，脑血疏口服液中的活性成分可能是通过作用于以上靶点起治疗作用。此外，在分子对接分析中发现，山柰酚与AKT1、SRC、PTGS2和EGFR具有较好的结合能力，说明关键活性成分山柰酚通过与这些靶点结合发挥作用可能是脑血疏口服液治疗缺血性卒中的重要机制之一。

将以上靶点进行GO功能和富集分析，共得到165个通路，涉及多个生物过程与分子功能。PI3K-Akt信号通路是参与缺血性卒中后细胞凋亡的重要信号传导通路，激活该信号通路，可对急性脑梗死后脑损伤起到保护作用[24]。如前所述，EGFR与脑损伤相关，推测脑血疏口服液的活性成分可能通过EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性通路发挥一定作用。缺血性脑卒中的发生中，首要原因是动脉粥样硬化引发颈动脉狭窄而导致，而该进程是由AGE-RAGE 信号通路参与的[25]，AGE-RAGE信号通路中也有5个靶点基因富集。

综上所述，本研究预测了脑血疏口服液中包括山柰酚、β-胡萝卜苷、胡萝卜苷等在内的多种活性成分，作用于AKT1、PTGS2、EGFR、SRC 等多个靶点，调控炎症反应、氧化应激应答、VEGF 信号通路、激酶活性等多种通路或生物过程、功能，通过多成分、多靶点、多通路的复杂网络防治缺血性卒中的分子机制，为其增加缺血性卒中这一临床适应证的可能性，提供理论依据，相关结果仍需进一步验证及临床研究来证实。