何平有，赵玉龙*，邹立宏，郁宏伟，吴雅清，焦玉兰，翟含流

[1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定 071000；2.保定市莲池区动物卫生监督所，河北保定 071000]

从2010 年春季开始，中国浙江、江苏、山东、河北和北京等省市相继暴发鸭坦布苏病毒病（DTMU），该病以鸭产蛋下降为最主要特征，不同日龄的北京鸭、樱桃谷鸭、金定鸭、麻鸭和康贝尔鸭等均可发病，雏鸭发病后期出现精神沉郁、体重减轻、仰翻、侧翻和死亡等临床症状，若细菌继发感染，出现肝周炎、心包炎和气囊炎等，死淘率增加给养鸭业造成了严重的经济损失。产蛋鸭发病后表现为持续性产蛋率低下，由于继发感染和饲养管理不当等因素可致死亡率达15%～20%。

疫苗免疫是预防该病流行、传播的有效手段。2016 年以来我国通过新兽药注册的鸭坦布苏病毒灭活疫苗和活疫苗各2 项（农业部公告第2400 号、第2416 号，农业农村部公告第73 号、第473 号颁布），2 类疫苗各有优缺点，灭活疫苗安全、有效，但需要多次免疫；活疫苗免疫产生期短，但有潜在毒力返强的风险。笔者为了提高鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫效果，进行了相关试验研究。

1 材料与方法

1.1 病毒液、试剂

2 批次鸭坦布苏病毒HB 株（DTMUV-HB株）病毒液，病毒含量分别107.0ELD50/0.1mL 和107.3ELD50/0.1mL，由瑞普（保定）生物药业有限公司生产部提供。国产轻质白油购至杭州某公司，进口白油和gel 佐剂购自赛比克公司。鸭坦布苏病毒HI 抗体检测试剂由瑞普（保定）生物药业有限公司提供。

1.2 试验动物

14 日龄健康樱桃谷鸭（坦布苏病毒抗原、抗体双阴性）购自河北某养殖场。

1.3 疫苗纯化试验

将2 批次鸭坦布苏病毒灭活病毒液先经科百特深层过滤系统过滤，再经300KD 中空纤维超滤浓缩10 倍，然后用PBS 还原，如此反复5 次；分别取纯化前、纯化中（深层过滤后）和纯化后（中空纤维超滤后）病毒液样品，测定样品病毒含量（按照农业部公告第2400 号方法）、总蛋白量（按现行兽药典测定方法进行）和SDS-PAGE分析，评价纯化效果。

1.4 佐剂筛选

取上述纯化方法制备的2 批次鸭坦布苏灭活病毒抗原液，分别与3 种优选佐剂配伍，制备灭活疫苗，6 组疫苗分别标记为：A01、A02、B01、B02、C01、C02。

佐剂A 疫苗配制：将轻质白油与司班80 按体积比94∶6 混合，126℃熬制1h 制成佐剂A；将上述灭活纯化抗原加入4%吐温80 制成水相；与佐剂A 按水油比1∶2 进行乳化，12000r/min剪切5min，在无菌条件下分装。

佐剂B 疫苗配制：将进口白油与角鲨烯按体积 比99 ∶1 的比例混合，再加入6% 司班80，126℃熬制1h 制成佐剂B；将灭活纯化抗原加入4%吐温80 制成水相；然后与佐剂B 按水油比1∶2 进行乳化，12000r/min 剪切5min，在无菌条件下分装。

佐剂C 疫苗配制：将灭活纯化抗原与佐剂C按体积比85∶15 混合，磁力搅拌30min，在无菌条件下分装。

1.5 疫苗检验

1.5.1 性状检验

取上述6 组疫苗进行外观、剂型、稳定性、黏度等项目检验。

1.5.2 安全性检验

将上述6 组疫苗分别接种14 日龄健康易感樱桃谷鸭，皮下注射，0.6mL/ 只，10 只/ 批，注射后观察14d。

1.5.3 效力检验

用14 日龄健康易感樱桃谷鸭10 只/ 组，各胸部肌肉接种6 组佐剂疫苗，0.3mL/ 只。免疫后21d，连同不接种的对照鸭5 只，采血分离血清进行鸭坦布苏病毒HI 抗体测定，并各肌肉注射DTMUV-HB 株病毒液0.5mL/ 只。攻毒后2d 对所有鸭进行采血，分离血清，接种鸡胚进行病毒分离，并对48～72h 死亡胚进行PCR 鉴定。

2 结果与分析

2.1 疫苗纯化试验结果

2 批次鸭坦布苏病毒灭活病毒液经过深层过滤、中空纤维超滤二级纯化，病毒含量下降不超过0.2 个滴度，而总蛋白下降到0.50mg/mL 以下，2 批次病毒液除杂率均高于80%，有效去除杂蛋白。详见表1 和图1。

表1 坦布苏病毒液纯化前后病毒含量和蛋白含量变化

图1 坦布苏病毒液纯化样品SDS-PAGE 情况

2.2 性状检验结果

3 种佐剂制备的6 组疫苗性状检验，外观、剂型和稳定性等均合格，佐剂A 和佐剂B 制备的疫苗为油佐剂疫苗，粘度适中为50～60cP；而佐剂C制备的疫苗为水性佐剂疫苗，粘度最低（表2）。

表2 不同佐剂鸭坦布苏灭活疫苗物理性状检验结果

2.3 安全性检验结果

3 种佐剂制备的6 组疫苗，免疫14 日龄樱桃谷鸭，观察14d 内免疫鸭均10/10 健活，精神、采食和粪便无异常，安全检验均合格（表3）。

表3 不同佐剂鸭坦布苏病毒灭活疫苗安全检验结果

2.4 效力检验结果

3 种佐剂制备的6 组疫苗，免疫14 日龄樱桃谷鸭，免疫21d 后测定鸭坦布苏病毒HI 抗体，并进行攻毒保护试验；佐剂B 组抗体水平和攻毒保护率最高，佐剂A 组次之，佐剂C 组最差。详见表4、表5 和图2。

表4 不同批次疫苗鸭坦布苏HI 抗体检验及攻毒保护试验结果

表5 不同批次疫苗攻毒保护试验数据统计表

图2 不同批次疫苗攻毒保护试验RT-PCR 检测结果（死亡胚）

3 讨论

近几年随着科技发展，鸭坦布苏病毒培养工艺由原来禽胚和贴壁细胞培养演变为全悬浮培养[2]，显著提升生产效率。全悬浮培养细胞密度大，破碎后的杂蛋白也多，部分杂蛋白在免疫反应中被免疫细胞识别，影响疫苗免疫效果，且增加免疫副反应发生几率。笔者通过深层过滤和超滤的方法处理抗原，处理后抗原的病毒含量下降（抗原损失）不超过0.2 个滴度，抗原总蛋白由原来2.1～2.3mg/mL 下降到0.36～0.38mg/mL（常规的细胞贴壁培养工艺病毒液总蛋白一般在1.2mg/mL左右），有效去除80%以上杂蛋白，显著提升抗原纯度，符合“新概念疫苗”理论[3]要求，制备的疫苗安全性好、不浪费动物机体的免疫力。

免疫佐剂是指一类能非特异性地增强或改变机体对匹配抗原的特异性免疫应答，可以增强抗原的免疫原性或者改变免疫的反应类型，但其本身并无抗原性的一类物质[4,5]。本研究采用2 种油佐剂（佐剂A 和佐剂B）和1 种水性佐剂（佐剂C）进行试验，结果显示油佐剂效果更好，最优的佐剂B 疫苗效力检验HI 抗体水平高达1∶320和攻毒保护率高达10/10，进口佐剂B 为鸭坦布苏病毒灭活疫苗优选佐剂，安全性和免疫效果均表现良好。

4 结论

笔者认为，油佐剂包裹鸭坦布苏病毒抗原，使抗原免受动物机体酶解与消除，纯化抗原缓慢释放，被机体更准确识别与提呈，使其产生高效免疫应答；另外，佐剂B 是一种矿物油，与角鲨烯配合能更好刺激机体局部产生炎症反应，从而辅助提高机体的整体免疫应答水平。2020 年任肖[6]采用免疫佐剂取得类似的效果，这从另一方面佐证了该技术应用效果。本研究为鸭坦布苏病毒病灭活疫苗的开发提供有益参考。