茆 骏

（安徽省马鞍山市博望区农业农村水利局，安徽马鞍山 243000）

奶牛乳房炎是一种常见的疾病，会给奶牛健康和产奶量带来很大的影响，从而影响奶牛养殖的经济效益。乳房炎不仅会导致奶牛产奶量下降，乳品质下降，甚至会导致奶牛提前淘汰。另外，由于乳房炎引起的乳房疼痛，可能会使奶牛的行为和情绪受到影响，导致生产性能下降。奶牛乳房炎的原因很多，其中细菌感染是主要原因之一，大肠杆菌、葡萄球菌等为常见致病菌。细菌感染可以通过许多途径传播，如乳房受伤、不合适的奶牛管理、不洁净的生产环境等[1]。奶牛乳房炎的治疗和预防需要首先确定病原菌的类型和数量，因此对奶牛乳房炎致病菌进行检测非常重要。

目前主要的检测技术有细菌培养法、PCR 检测法、激光流式细胞仪检测、体细胞计数等，其中体细胞计数不能鉴定具体的致病菌，只能间接评估是否存在乳腺炎，激光流式细胞仪检测需要专业实验室和设备，成本较高；细菌培养法需要培养时间长并且可能会漏检微生物且检测误差较大，因为一些微生物难以在培养基上生长，灵敏度较低。对于某些细胞难以培养或生长速度较慢的致病菌，该方法可能会漏诊或误诊。病原体抗体检测也是一种简单的检测方法，可以通过血清或乳汁样本来检测奶牛体内的病原体抗体，以确定奶牛是否感染了特定的致病菌。可以在感染早期就进行检测，减少疾病的传播。对于一些难以培养或者检测的病原体，该方法可以提供补充诊断信息。但其缺点是病原体抗体检测不能直接检测致病菌，只能检测感染后奶牛体内产生的抗体，因此有一定的局限性。不能确定病原体的药物敏感性，并且需要对不同致病菌进行特定的抗体检测，因此检测成本较高，不适合大规模应用。PCR 检测技术准确性高，非常快速，可以在数小时内得出结果，灵敏度要高于细菌培养法[2]。因此本文采用多重PCR 技术以建立可靠的奶牛乳房炎致病菌的检测方法，并用临床乳样进行验证，证明其检测方法的灵敏与准确，为早期诊断和临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、化脓性链球菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、巴氏杆菌、乳房链球菌和停乳链球菌，均由安徽省马鞍山市某牧场提供。

1.2 培养基及试剂

高纯度耐热DNA 聚合酶2×Taq Master Mix(Dye Plus)、DNA 标准品购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司、细菌基因组DNA 提取试剂盒购买自上海晶诺生物科技有限公司；4 种致病菌引物由北京擎科生物科技有限公司进行合成，琼脂糖、MB 培养基及琼脂糖凝胶电泳装置均参照广东环凯微生物科技有限公司说明书配制和使用。

1.3 仪器设备

实时荧光定量PCR 仪（伯乐CFX Opus Deepwell）购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；琼脂糖水平电泳仪（DYCP-32A 型，中号）购自北京六一生物科技有限公司；超净工作台（SW-CJ-2FD）购自绍兴上虞艾科仪器公司；立式压力蒸汽灭菌器（MVS-63/63G）购自冰山松洋生物科技（大连）有限公司。

2 实验方法

2.1 引物设计与合成

参考GenBank 中的大肠杆菌pho A 基因（位置501～1166）、金黄色葡萄球菌nuc 基因（位置88～564）、无乳链球菌tuf 基因（位置529～815）、以 及肺炎克雷伯氏菌khe 基因（位置185～393），使用Primer 6.0 软件进行特异性引物的设计，最终设计引物以15～30bp 范围以内，4种致病菌的引物设计分别为CGTTTCTACCGCAGAGTTG、GGGCAATACGCAAAGAGG、TGGT GTTCTTCTTCGTGGTG、AGAGCGATGAGGAA GAGTTCA（序列均为5'→3'），引物最终由北京擎科生物科技有限公司合成。

2.2 模板DNA 的制备

先取细菌培养液2mL，10000r/min 离心1min，吸走上清液，向下层菌体中加入200μL 的EDTA 缓冲液，震荡悬浮，再加入20μL 蛋白酶K 溶液以及200μL EDTA 缓冲液，混匀震荡15s后高温70℃静置10min，再加入无水乙醇震荡15s，将所得溶液及絮状物加入吸附柱中以12000r/min 离心30min 后弃置上清液，将吸附柱装入收集管中，重复吸附柱收集过程直至得到足够数量收集管，吸附膜中间加入200μL EDTA 缓冲液静置5min，12000r/min 离心30s 得到模板DNA 溶液。

2.3 引物PCR 扩增和鉴定

以2.2 提取到的4 种细菌DNA 为模板进行PCR 扩增。具体使用Taq Master Mix 10μL、模板2μL、上下游的引物各1μL、最后使用超纯水使反应体系体积最终达到20μL。PCR 扩增反应的条件设置为：93℃条件下预变性5min，以93℃40s、54℃40s、72℃30s 为一个循环，共设置35个循环，最终以72℃延伸10min。最后取0.5μL的扩增产物进行葡聚糖凝胶电泳实验进行分析[3]。

2.4 特异性和灵敏度试验

以2.2 获得的4 种模板DNA 混合溶液作为模板，同时以不是这4 种菌株基因组DNA 的其他菌株基因组DNA 一级超纯水作为对照，按2.3 方法进行引物的PCR 扩增，以检测PCR 扩增技术的特异性。用核酸蛋白定量仪对4 种DNA 模板溶液进行浓度测定，并将这4 种浓度已知的致病菌的模板DNA 进行梯度稀释后，按2.3 方法进行PCR 技术扩增，并观察比较PCR 扩增灵敏度。

2.5 临床乳样的PCR 检测应用

从牧场提供的样本中获取15 份具有典型奶牛乳房炎临床症状的乳样，使用设计好的PCR 技术检测方法进行检测，以及传统的细菌培养法进行检测，对两种方法的4 种致病菌阳性检出率进行比较，并根据式（1）计算检测方法的共同符合率。

式（1）中，A 表示两种方法都检测到目标致病菌的样本数量；B 表示只有PCR 技术检测到目标致病菌的样本数量；C 表示只有细菌培养法检测到目标致病菌的样本数量；D 表示两种方法都未检测到目标致病菌的样本数量。

3 实验结果

3.1 PCR 扩增结果

利用2.1 中设计的PCR 扩增引物扩增4 种菌株的特异基因片段，琼脂糖凝胶电泳如图1 所示，使用大肠杆菌pho A 基因特异性引物对大肠杆菌DNA 模板扩增出的片段长度约为660bp，使用金黄色葡萄球菌nuc 基因对金黄色葡萄球菌DNA 模板扩增出的片段长度约为475bp，使用无乳链球菌tuf 基因特异性引物对无乳链球菌PCR扩增出的片段长度均约为288bp，使用肺炎克雷伯氏菌khe 基因特异性引物对肺炎克雷伯氏菌PCR 扩增出的片段长度均约为210bp，3 次重复PCR 扩增实验结果相同，大小与预期相符。

图1 PCR 扩增片段琼脂糖凝胶电泳结果。

3.2 特异性和灵敏度试验结果

以4 种模板DNA 混合溶液作为模板，同时扩增4 种目标菌株片段以及非目标菌株片段（使用化脓性链球菌、产酸克雷伯菌、蜡样芽孢杆菌、产气肠杆菌、巴氏杆菌、以及乳房链球菌），琼脂糖凝胶电泳结果如图2 所示。PCR 扩增技术可以扩增出目标菌株大肠杆菌的660bp 片段、无乳链球菌475bp 片段、金黄色葡萄球菌288bp 片段、肺炎克雷伯氏菌的210bp 片段的目标条带，而其他非目标菌株均为扩增出相近的片段，证明本试验中PCR 扩增技术对4 种目标菌株的特异性强，准确性高。敏感性试验中，用核酸DNA 定量装置对4 种DNA 模板溶液进行浓度测定，结果显示4 种致病菌的浓度分别是170.2、189.5、106.4、202.8ng/μL，将其稀释不同倍数后进行PCR 扩增，结果显示四种致病菌的模板DNA 最低测出浓度分别为17.02、18.59、10.2、21.1μg/μL，证明PCR 扩增技术对目标菌株DNA 的浓度要求不高，反映出PCR 检测技术的高灵敏度。

图2 PCR 扩增片段琼脂糖凝胶电泳特异性结果

3.3 临床乳样检测结果

对牧场提供的30 份疑似奶牛乳房炎的乳样分别进行PCR 检测技术和传统细胞培养检测技术检测，结果如表1 所示。使用PCR 技术的乳样4种致病菌检出率为83.3%，而细菌分离培养法的致病菌检出率为73.3%，两种检测方法同时检测出4 中致病菌的符合率为92.4%。从结果看使用PCR 检测技术要优于细菌分离培养检测技术。

表1 30 份乳样使用PCR 技术和细菌分离培养技术样品检测结果

4 讨论

乳房炎是奶牛最常见的疾病之一，是乳房组织感染引起的炎症反应。这种疾病严重影响了奶牛的健康和生产性能。奶牛乳房炎的主要症状是乳汁异常，如颜色、气味和质地的变化。奶牛乳房炎会导致乳汁质量下降，含有更多的细胞、蛋白质和脂肪，而牛奶的产量也会受到影响，使得奶牛养殖产生较大的经济损失。奶牛乳房炎会导致奶牛的乳房发炎、肿胀，甚至化脓，这会给奶牛带来疼痛和不适。长期的乳房炎症还可能引发其他疾病，如乳腺瘤、乳腺增生等。另外，奶牛乳房炎是由细菌等微生物引起的疾病，如果不及时处理和治疗，细菌可能会扩散到奶牛的其他部位或者其他奶牛身上，从而导致更多的感染和疾病传播，甚至影响人类的健康[4]。奶牛乳房炎的病因很多，包括细菌病毒真菌和寄生虫等微生物感染。常见的细菌包括溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等[5]。

在奶牛乳房炎的诊断与治疗过程中，准确鉴定主要致病菌是至关重要的。目前PCR 检测可以对多种致病菌进行同时检测，并能够检测出极少量的致病菌，并且可以通过PCR 技术对特定的致病菌进行快速检测，相较于传统方法，可大大缩短检测时间，提高检测效率，PCR 技术的引物序列设计较为特异，能够准确区分不同的病原菌种类。但缺点是技术较为复杂，需要购买较为昂贵的试剂盒，需要高度的技术操作和严格的实验控制，另外引物选择有一定的局限性，需要根据病原菌的特异性进行设计[6]。

本研究基于PCR 技术设计了一种病原菌鉴定方法。选择了大肠杆菌pho A 基因、金黄色葡萄球菌nuc 基因、无乳链球菌tuf 基因和肺炎克雷伯氏菌khe 基因进行检测，以上4 种基因片段在许多细菌中存在，但是这些基因序列在不同菌株之间的变异程度非常小，在不同的细菌中有着高度相似的序列，且相对稳定地保持着这种相似性。这使得这些基因能够作为检测不同菌株的工具，因为它们具有高度一致性，不易受到基因变异的影响。使用特异性引物扩增出的片段特异性良好，特异性试验结果表明PCR 扩增技术对选定的4 种致病菌的模板DNA 特异性强，不会对其他菌株DNA 进行扩增，因此PCR 检测的准确性得以保证。该方法用于细菌培养物或临床样本的检测灵敏度较高，能够准确地鉴定病原菌，保证了PCR 检测方法的灵敏性。对30 份临床样本的PCR 分子检测验证结果表明，该方法能够在提取基因组DNA 后的一天内检测分析出奶牛乳房炎感染的致病菌，另外将检测结果与细菌分离培养法进行比较，可以发现PCR 检测技术不仅检测时间更快，病菌阳性检出率高于细菌分离培养，2种检测方法符合率答92.4%，证明PCR 检测技术的更加高效迅捷。

5 结论

本试验设计构建了基于PCR 技术对奶牛乳房炎主要致病菌的检测方法，通过琼脂糖凝胶电泳试验证明对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌4 种致病菌的模板DNA的PCR 扩增成功，特异性试验和灵敏度试验证明该PCR 检测方法对目标细菌的检测灵敏度以及准确率都很高。最后对牧场提供的疑似牛乳房炎30份乳样分别进行PCR 技术和细菌分离培养技术检测，PCR 技术对4 种致病菌的检出率要高于细菌分离培养法，能快速精准地检测出致病菌，证明PCR 检测技术可以实际应用于临床，满足对奶牛乳房炎病菌检测的实际需求，为提高奶牛规模场的动物健康管理和质量把控提供新检测方法和参考依据。