谢灿明，江姗姗，王 瑶，向 静，刘晓月，唐 红，李展富，汪红娟，陈楚淘，田浩梅

1.湖南中医药大学针灸推拿与康复学院（湖南 长沙 410208）；2.安徽中医药大学第二附属医院康复中心（安徽 合肥 230061）；3.成都中医药大学针灸推拿学院（四川 成都 610075）；4.湖南省妇幼保健院中医科（湖南 长沙 410008）

脑卒中（cerebral apoplexy）是全球第二大死亡原因［1］，其中缺血性脑卒中占70%以上，具有极大的危害性［2］。血管复通是治疗缺血性脑卒中的重要手段，但在此过程中可能会加重神经组织损伤和肢体功能障碍，此过程被称为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI），脑缺血后神经元损伤的程度是决定预后的主要因素，寻找有效降低神经元损伤的方法十分重要。环状RNAs（circRNAs）是一类具有特殊结构的非编码 RNA，其功能多样，充当微小RNAs（miRNAs）的“海绵”是其中之一，circRNAs 竞争性结合并以海绵样方式吸附miRNAs，阻止miRNAs 与其靶信使RNAs（mRNAs）结合，从而调控靶基因的表达，即竞争性内源RNA（ceRNA）机制［3］。 研究［4-6］表明，circRNAs 的表达与神经元发育以及多种神经系统疾病紧密联系，通过高通量测序在大、小鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的脑组织中发现了变化的circRNAs 表达谱，并对其中差异表达的circRNAs 宿主基因和mRNAs进行基因本体（GO）数据库功能富集分析，发现其涉及脑形态发生、神经元到神经元突触等多种生物学过程［7-9］，提示circRNAs 有望成为CIRI 治疗新靶点。课题组前期研究［10-11］证实，针刺“大椎”“水沟”“百会”穴可通过调整多种蛋白功能与多条信号转导通路抗神经元损伤，从而保护缺血损伤的脑组织。既往研究发现针刺可能通过调节circRNAs 的表达对其他疾病产生影响［12-13］，因此本研究以circRNAs 为切入点，探讨针刺对CIRI 大鼠脑组织的保护作用与差异表达核心基因、转录网中mRNAs 功能之间的联系，进而为针刺调控circRNAs抗CIRI后神经损伤提供相关参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF 级健康雄性SD 大鼠54 只，体质量220～250 g，由湖南中医药大学动物实验中心提供。动物生产合格证号：SCXK（湘）2020-0004。动物使用合格证号：SYXK（湘）2019-0009。饲养条件为SPF 级动物房。室温（25±1）℃，环境湿度40%～60%，每日12 h 光照时间，不限制进食、饮水。本实验方案通过湖南中医药大学实验动物福利和伦理委员会审查（伦理批准号：LL2021081203）。

1.1.2 主要药物与试剂 戊巴比妥钠，德国Merck Kgaa 公司（批号：2203172）；2% 2,3,5-三苯基氯化四唑（TTC）溶液，北京雷根生物技术有限公司（批号：DK0005）；多聚甲醛，北京白鲨易生物科技有限公司（批号：BL539A）；二甲苯，国药集团化学试剂有限公司（批号：10023418）；甲苯胺蓝染液，武汉塞维尔生物科技有限公司（批号：G1032）；超纯总RNA 提取试剂盒，康为世纪生物科技股份有限公司（批号：CW0581S）；第三代全长cDNA 一链合成试剂盒（去基因组）［HiScript Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）］、通用型高特异性染料法定量PCR 检测试剂盒（AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix），南京诺唯赞生物科技股份有限公司（批号：R312-01、Q511-02）。

1.1.3 主要仪器 MCAO 栓线，北京西浓科技发展有限公司［规格：（0.32±0.02）mm］；恒温水浴锅，上海南阳仪器有限公司（型号：HHS-2）；扫描仪，美国Agilent 公司（型号：G2505C）；荧光定量 PCR 仪，美国Applied biosystems 公司（型号：ABI 7500）；包埋机，武汉俊杰电子有限公司（型号：JB-P5）；病理切片机，上海徕卡仪器有限公司（型号：RM2016）；无菌毫针，苏州针灸用品有限公司（规格：0.25 mm×13 mm）；circRNA芯片及芯片标记试剂盒，美国Arraystar 公司（型号：Human circRNA Array V2）。

1.2 分组与造模 大鼠常规饲养7 d后，采用随机数字表法选取18只大鼠定为假手术组，其余大鼠进行造模，造模成功后的大鼠随机分为模型组和针刺组，每组18 只。造模方法：造模前24 h 大鼠禁食，正常饮水，2%的戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔麻醉，参照从颈总动脉插入线栓的Longa 线栓法［14］并加以改良制备大鼠右侧MCAO/R模型。造模结束后将大鼠轻放于恒温垫保温，待大鼠麻醉完全苏醒后，参照Longa 评分法［14］进行评定，1～3分的大鼠纳入实验。假手术组大鼠仅用玻璃分针分离颈总动脉、颈内外动脉。

1.3 干预方法 假手术组与模型组大鼠用鞋带捆绑四肢，俯卧位固定于鼠板30 min，每12 h干预1次，共7次。针刺组在假手术组与模型组基础上增加针刺操作，参考《实验针灸学》［15］和大鼠实验图谱［16］针刺“大椎”“水沟”“百会”穴，均匀捻转刺激1 min，频率为90 次/min，15 min后行针1次，共留针30 min。

干预期结束，大鼠完成改良Garcia 评分后，予2%的戊巴比妥钠（3 mL/kg）腹腔麻醉。全脑组织：迅速取大鼠全脑，置于-20 ℃冰箱中冷冻10 min，每组抽取5 只用作TTC 染色；用质量分数为0.9%的氯化钠溶液简单冲洗全脑组织，放入装有4%多聚甲醛的容器中固定24 h 以上，每组抽取5 只用作尼氏染色。海马组织：将取出的全脑组织置于冰盒分离缺血侧海马组织，每组随机抽取3 只用于基因芯片检测，5 只用于实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 神经功能损伤情况 采用改良Garcia 评分法［17］在首次针刺前和末次针刺后评估大鼠的运动功能与感觉功能，各项总计18 分，神经功能损伤越严重则得分越低。

1.4.2 TTC 染色法检测大鼠脑梗死面积 将冷冻的全脑组织置于冰上，去除后侧的小脑和低位脑干、前侧的嗅球，将脑组织按冠状位平均切成5 个脑片，每片厚薄均匀，约2 mm，放入玻璃烧杯，再倒入2% TTC 溶液，放入37 ℃水浴箱中，共染10 min，中途翻一次面，染色过程中全程避光；在染色结束后，倒入4%多聚甲醛固定，1 d 后用相机拍照。将图片导入ImageJ 软件进行脑梗死面积的测量，导出数据后利用Swanson公式［18］计算脑梗死面积百分比。

1.4.3 基因芯片技术筛选差异表达基因中的核心circRNAs 及GO 功能富集分析 测定RNA 样品的浓度和纯度后，利用核糖核酸酶R 去除各样品线性RNA 并富集circRNAs，将其扩增并转录为荧光cRNA后进行纯化，标记的cRNA 被杂交到Arraystar 大鼠circRNA 阵列，将装有杂交液的玻片装配到circRNA 表达芯片玻片，经过孵育、清洗与固定后，使用安捷伦提取软件G2505C 进行扫描，利用R 软件limma 包进行数据处理。以差异倍数（FC）＞1.25，P＜0.05 为筛选标准整理出模型组/假手术组、针刺组/模型组共同差异表达的circRNAs（co-DE circRNAs），再根据P值、FC、GO 条目富集数量筛选出高表达的核心co-DE circRNAs，根据在线数据库（http：//www.geneontology.org）对核心co-DE circRNAs 的来源基因进行GO 功能富集分析，应用“微生信”网站将结果进行可视化分析。

1.4.4 尼氏染色法观察缺血侧海马组织神经元受损情况 石蜡切片脱蜡至水，入甲苯胺蓝染液5 min，水冲洗，1%的冰醋酸稍分化，自来水洗终止反应，监测分化程度；自来水洗后，将切片放置于烤箱烤干，二甲苯透明5 min，中性树胶透明封片。在显微镜下观察各组大鼠脑组织切片的染色结果，主要观察海马CA1 区神经元病理形态学，使用CaseViewer 软件查看图像，50 μm标尺下观察海马CA1 区神经元数量。每张切片随机采集3个视野，利用ImageJ软件统计缺血侧海马CA1区尼氏染色阳性细胞数，比较各组大鼠海马CA1 区神经元损伤程度。

1.4.5 RT-qPCR法验证核心 circRNAs表达量 每组随机取5 只大鼠冻存患侧海马组织。取30～50 mg 在液氮中研磨，参照说明书用超纯RNA 提取试剂盒提取RNA、合成cDNA，采用第三代全长cDNA一链合成试剂盒（去基因组）进行cDNA 反转录，以β-肌动蛋白基因（β-actin）为内参，进行RT-qPCR 扩增以检测各组缺血侧海马组织中核心circRNAs 的表达水平。反应条件：95 ℃预变性10 min；40个循环（95 ℃，15 s；60 ℃，60 s）。每个样本检测3 个复孔，按照2-ΔΔCt公式计算出相对表达量结果，核心基因引物由上海康成公司提供。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4.6 核心 circRNAs 的ceRNA 网络构建及mRNA 的GO 功能富集分析 选取经RT-qPCR 验证后与芯片结果一致的circRNAs 进行ceRNA 网络预测，利用基于TargetScan 和 miRanda 的自制靶点预测软件，以SeqMirnaCoverage＞0.3、CeMirnaCoverage＞0.3、P＜0.05 为条件［19］，筛选出对应的miRNAs 和mRNAs，构建ceRNA调控网络，使用 Cytoscape 3.8.2 软件对调控网络进行可视化展示，将预测的mRNAs 进行GO 分析，应用“微生信”网站（https：//www.bioinformatics.com.cn）将结果进行可视化分析。

1.5 统计学方法 所有数据均采用SPSS 25.0 软件进行统计分析。实验数据用进行统计描述；不符合正态性分布则使用非参数检验，以中位数与四分位间距［M（Q）］表示。组内干预前后比较时，符合正态分布的资料用配对t检验，不符合则采用配对秩和检验。各组间比较时，满足正态性分布的资料使用单因素方差分析，方差齐者用 LSD 法，方差不齐者用Games Howell法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对大鼠改良Garcia 神经功能评分的影响 针刺干预前，与假手术组比较，各造模组神经功能评分显著降低（P＜0.05），且各造模组间差异无统计学意义（P＞0.05）。末次针刺干预后，与假手术组比较，各造模组神经功能评分显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组评分显著升高（P＜0.05）；组内干预前后比较，模型组和假手术组神经功能评分差异无统计学意义（P＞0.05），针刺组神经功能评分显著升高（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠改良Garcia神经功能评分比较

2.2 对大鼠脑梗死面积比的影响 TTC 染色后，模型组与针刺组均出现白色梗死灶。与假手术组比较，模型组脑梗死面积比显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组脑梗死面积比显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠脑梗死面积比较

2.3 基因芯片检测

2.3.1 对大鼠缺血侧海马组织circRNAs 差异表达谱的影响 假手术组、模型组、针刺组各取3 只大鼠海马组织进行基因芯片检测，将差异circRNAs用聚类图展示，结果详见图3。

图3 circRNAs差异表达谱

2.3.2 对大鼠缺血侧海马组织circRNAs 差异表达数量的影响 模型组相较假手术组共有603 个差异表达circRNAs，其中288 个上调，315 个下调；针刺组相较模型组共有51个差异表达circRNAs，其中33个上调，18个下调。模型组下调/针刺组上调、模型组上调/针刺组下调的co-DE circRNAs为 23个。见表2。

表2 co-DE circRNAs芯片数据

2.3.3 核心co-DE circRNAs的筛选 以FC＞1.25、P＜0.05为条件，根据co-DE circRNAs 来源基因富集的GO 条目个数，见图4。筛选出排名前2 的核心基因为组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）和神经营养受体酪氨酸激酶2（NTRK2），其中芯片结果显示HDAC2为针刺干预后上调基因，NTRK2为针刺干预后下调基因，二者对应的circRNA 分别为rno_circ_009775和rno_circ_006893，根据来源基因，分别将其命名为circHDAC2和circNTRK2。

图4 co-DE circRNAs 来源基因富集的 GO 条目计数

2.3.4 大鼠缺血侧海马组织circHDAC2、circNTRK2来源基因的GO 功能富集分析 GO 富集分析由生物过程（BP）、细胞成分（CC）和分子功能（MF）组成，可初步探讨基因产物在生物体中的潜在功能。选取每个模块富集分数前10 的条目进行绘图，可见circHDAC2、circNTRK2来源基因在BP 富集于神经元的产生、神经系统发育、神经元分化等；在CC 富集于细胞质、细胞内膜结合细胞器、高尔基体等；在MF 富集于神经营养因子结合、蛋白质结合、激酶结合等。见图5。

图5 circHDAC2、circNTRK2来源基因的GO分析

2.4 大鼠缺血侧海马组织CA1区神经元尼氏染色 假手术组CA1 区神经细胞结构完整，排列整齐，细胞核多呈圆形，核仁清晰，细胞质深染，尼氏体数量多；与假手术组比较，模型组CA1 区神经细胞形态多呈空泡状，核仁不明显，尼氏体数量减少；与模型组比较，针刺组细胞结构较为完整，核仁较清晰，胞浆明显，尼氏体数量增加，海马CA1 区神经元损伤减轻。与假手术组比较，模型组缺血侧海马 CA1区神经元尼氏染色阳性细胞数降低（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组神经元尼氏染色阳性细胞数升高（P＜0.05）。见图6 A、图6 B。

图6 各组大鼠缺血侧海马组织CA1区神经元尼氏染色情况比较

2.5 对大鼠缺血侧海马组织circHDAC2、circNTRK2表达量的影响 与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧海马组织circHDAC2、circNTRK2表达量均显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，针刺组circHDAC2、circNTRK2表达量均显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。其中circHDAC2表达趋势与芯片结果一致，circNTRK2表达趋势与芯片结果相反，根据显著性结果及表达趋势，选择circHDAC2进行下一步研究分析。见图7。

图7 各组大鼠缺血侧海马组织circHDAC2、circNTRK2表达量比较

2.6circHDAC2调控网络的构建及mRNAs的GO分析2.6.1circHDAC2调控网络的构建 基于TargetScan 和miRanda 的自制 miRNA 靶点预测软件，以SeqMirnaCoverage＞0.3、CeMirnaCoverage＞0.3、P＜0.05 为条件筛选circHDAC2对应的miRNAs 和mRNAs，构建ceRNA 调控网络，结果显示有12 个miRNAs，31 个mRNAs。见图8。

图8 circHDAC2相关ceRNA调控网络可视化结果

2.6.2circHDAC2调控网络中的mRNAs 的GO 分析

将预测出的ceRNA 调控网络中的mRNAs 进行GO 分析，可见其在BP 富集于神经元的产生、神经元分化的调控、轴突引导、神经系统发育、神经元死亡的调节等，在CC 富集于神经元细胞体、突触、细胞质等，在MF 富集于微管结合、神经递质跨膜转运蛋白活性、丝裂原活化蛋白激酶结合等。见图9。

图9 调控网络中mRNAs的GO分析结果

3 讨论

CIRI归属于中医学“中风”范畴。一般认为本病多因气血亏虚，心、肝、肾三脏失调，复因劳逸失度、内伤积损、情志不遂、饮酒饱食或外邪侵袭等触发，进而导致机体阴阳失调，气血逆乱。其病位在脑，与心、肝、脾、肾相关。“脑髓损伤，神机失用”是中风发病之病机关键，“督脉痹阻”是其发病之经络学基础［20］，因此脑部疾病的诊治常以督脉循经选穴为主。现代研究［21-22］也证实，针刺督脉穴位对于中风的疗效优于普通针灸选穴。本研究选取的大椎、水沟、百会均为督脉要穴。大椎为督脉入脑之枢纽要穴，刺之可通督醒脑，活血行气；水沟为督脉和手足阳明经的交会穴，可醒神开窍、熄风止痉；百会位于头顶正中，为百脉聚会处，可生精补髓，调理五脏六腑之功能。三穴相配，共奏补益脑髓、通督醒神之功。课题组前期研究［23-24］已证实针刺对CIRI 疗效确切，其机制可能与抑制细胞凋亡及调控多种类miRNAs 的表达相关。本研究结果显示，造模后，大鼠神经功能评分均显著降低，TTC 染色出现白色梗死灶，且脑梗死面积比升高，提示造模成功。针刺后，针刺组大鼠神经功能评分显著升高，脑梗死面积比下降，说明针刺可改善CIRI大鼠神经功能损伤，减少脑梗死面积，进而实现对脑的保护作用。

circRNAs是通过特殊的剪切方式将RNA的3'和 5'端通过共价键相连而形成的一种非编码RNA，具有高度丰富性、高稳定性和保守性［25］。circRNAs 在哺乳动物的神经元组织中高度富集，涉及神经细胞凋亡、增殖、分化以及脑缺血后神经细胞损伤［26］。目前，尽管针刺调控circRNAs 的表达抗 CIRI 鲜有研究报道，但针刺调控其他非编码RNA的表达从而发挥治疗作用已有相关文献报道。例如张亚敏等［27］采用电针“百会”“足三里”穴治疗大鼠CIRI，结果显示电针可以降低脑组织及血清miR-29的表达，提高miR-320表达水平，减轻 CIRI后脑损伤。课题组前期研究［28］亦证实，CIRI 大鼠海马组织miRNAs表达谱在针刺后可发生改变，并且针刺可下调miR-106b-5p、上调miR-34c-5p，提示针刺改善CIRI 大鼠神经功能、减少脑梗死面积可能与针刺调控miRNAs 的差异表达以及激发其功能有关。本研究通过基因芯片技术识别出针刺后的CIRI大鼠海马组织中差异表达的circRNAs，并筛选出高表达的核心co-DE circRNAs 为circHDAC2 和circNTRK2。其中芯片结果显示，HDAC2为针刺干预后上调基因，NTRK2为针刺干预后下调基因。二者GO 功能富集分析涉及神经元的产生、神经系统发育、神经元分化，可见核心基因GO 分析结果与神经元密切相关。海马对机体氧含量的变化最敏感，CIRI后海马最先受到损伤，而海马CA1区神经元最为敏感［29］，因此本实验对海马CA1 区域的神经细胞进行计数。本实验结果显示，模型组缺血侧海马组织CA1 区神经元尼氏染色阳性细胞数降低，而在针刺后显著升高，证实针刺可减轻缺血侧海马组织神经元损伤。核心基因circHDAC2、circNTRK2的GO 功能富集分析结果与针刺所显示的效应一致。

进一步对核心基因circHDAC2、circNTRK2进行验证发现，与假手术组比较，模型组大鼠缺血侧海马组织circHDAC2、circNTRK2表达量均显著下调；针刺后二者表达量均显著上调，其中circHDAC2表达趋势与芯片结果一致，circNTRK2表达趋势与芯片结果相反，提示circHDAC2可能是针刺抗CIRI 的高表达关键靶点。且文献［30］研究也显示，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是调节细胞内蛋白乙酰化的一种重要酶，可减轻脑缺血后神经元损伤，对中风具有神经保护作用。本研究中circHDAC2定量分析、GO 功能富集分析、尼氏染色的结果恰也提示circHDAC2可能是针刺抗CIRI 后神经损伤的关键靶点。

circRNAs 最主要的生物学功能是“海绵作用”。研究［31］显示，circTLK1可充当miR-335-3p的“海绵”进而调节靶基因TIPARP的表达，进而促进缺血性脑卒中神经元损伤。本实验针对高表达关键靶点circHDAC2构建调控网络，结果显示调控网络有12 个miRNAs、31 个mRNAs。对这些mRNAs 进行GO 分析，发现其富集于神经元的产生、神经元分化的调控、轴突引导、神经系统发育等BP，神经元细胞体、突触、细胞质等CC，微管结合、神经递质跨膜转运蛋白活性、丝裂原活化蛋白激酶结合等MF。以上富集分析结果与神经损伤联系紧密，故推测circHDAC2抗CIRI 后神经损伤可能与调控网络中的mRNAs 相关，但具体是何种mRNA 还需要进一步验证。

综上所述，针刺“大椎”“水沟”“百会”能显著改善CIRI 大鼠神经功能评分与脑梗死面积比，减轻缺血侧海马组织神经元损伤，其机制可能与针刺调控缺血侧海马组织circHDAC2表达以及激发调控网络中mRNAs神经元的产生、神经元分化、神经元细胞体功能等有关。本实验未涉及调控网络中的miRNAs、mRNAs以及神经元损伤相关蛋白的验证，以上机制还需进一步深入研究。