成镜　黄天带　戴雪梅　徐正伟

关键词：橡胶树；花药；胚性愈伤组织；植株再生

中图分类号：S794.1 文献标识码：A

橡胶树体胚植株具有生长快、产量高等优点，其产量较同源老態芽接无性系增加了25.8%～66.3%[1-3]，生长快10%～20%[1]，是天然橡胶产业发展的新一代种植材料。中国热带农业科学院橡胶研究所（以下简称“中国热科院橡胶所”）组培与转基因课题组建立了以花药为外植体的橡胶树热研7-33-97 品种的体胚发生再生技术体系，目前能够实现规模化生产的橡胶树品种仅热研7-33-97，橡胶树体胚植株品种覆盖度不足限制了其应用面积。因此，为了提高橡胶树体胚植株的推广应用面积，亟待研发其他优良品种的体胚再生技术体系。

橡胶树热垦628 品种具有生长快、产量高、抗性强、冠幅小、宜植区域广的优点，是中国热科院橡胶所自主选育的农业农村部“十四五”主推品种。通过对海南、云南、广东3 个区域试验点适应性试种的热垦628 的系统观测，整体表现出了速生、产量高、抗逆性好的特性及良好的适应性，是具有较大推广应用价值的胶木兼优品种[4]。胶园产值低是目前天然橡胶产业面临的难题，在橡胶林下间作耐阴作物可提高胶园产值，由于热垦628 树型是单杆型，分支较少，是最适合林下间作的品种。常规胶园每667 m 种植33 株（株行距3 m×7 m），中国热科院橡胶所进行示范种植的宽窄行（株距2 m，窄行距4 m，宽行距20 m）种植每667 m 种植28 株，使用体胚苗理论上可以增产20%，达到节本增效的效果。

为了成功地建立橡胶树体胚发生再生技术体系，首先需要获得较高质量的胚性愈伤组织，否则难以进行后续的体胚发生和植株再生过程。为了诱导出胚性愈伤组织，研究者们从基因型[5]外植体类型[6-7]植物生长调节剂[8]、蔗糖、钙[9-10]、其他添加物[11]等方面进行研究，但效果不明显。

本研究以橡胶树雄花花蕾为材料，通过改变培养基中的植物生长调节剂、蔗糖、氨基酸、钙含量、硝酸银等研究其对胚性愈伤组织诱导的影响，以期在较短的时间内获得胚性愈伤组织，为后续的体胚发生再生技术体系打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以种植于中国热科院试验场三队的橡胶树热垦628 品种的花药为材料，在春花期采集花蕾长度为2.5～3.0 mm、显微镜观察花粉粒处于单核期且发育良好的雄花进行接种培养。

1.2 方法

1.2.1 花药愈伤的诱导 摘取新鲜的雄花花蕾，75%的乙醇处理30 s，0.1%的HgCl 溶液浸泡10 min，浸泡期间不停晃动，使灭菌彻底，无菌水冲洗4～5 次，每次5 min。解剖针剥开花蕾，将花药柱连同花药接种于试管中，每管接种4 个花药外植体。灭菌和接种均在超净工作台上进行。

1.2.2 正交试验设计 将经过无菌消毒的橡胶树雄蕊接种于含有MS 大量、MS 微量、MS 有机、肌醇0.1 g/L，0.4 mg/L 硫胺素，不同毒莠定、KT、6-BA、IAA 浓度的培养基中，并补充天冬酰胺300 mg/L、水解酪蛋白100 mg/L、脯氨酸100 mg/L、精氨酸100 mg/L、谷氨酰胺100 mg/L、L-半胱氨酸、盐酸盐50 mg/L、蔗糖70 g/L、椰子水50 mL/L、植物凝胶2.2 g/L，毒莠定、KT、6-BA、IAA 浓度采用五因素四水平正交表进行设计（表1）；培养容器为带透气膜的玻璃试管，pH 5.8，在温度为28 ℃的条件下培养30 d。采用五因素四水平L16（45）正交表设计，分别设置毒莠定浓度（因素A）、KT 浓度（因素B）、6-BA 浓度（因素C）、IAA 浓度（因素D）的五因素四水平正交试验（表2）。每个处理组合40 个外植体，重复3 次，接种20 d 后统计愈伤诱导情况。

1.2.3 体细胞胚的诱导 将上述愈伤组织转入体细胞胚诱导培养基中进行体细胞胚诱导以测试其是否为胚性愈伤，体胚发生为25 ℃暗培养。体胚发生培养基配方参照黄天带等[12]的配方。每个处理重复3 次，每个处理2 皿，每个处理共20 个外植体，转入体细胞胚诱导培养基后45 d，统计体胚诱导率。

1.2.4 植株再生测试 将上述获得的正常体胚转入植株再生培养基中进行植株再生，植株再生培养基参考华玉伟等[13]的配方及培养条件。

1.3 数据处理

实验数据用Excel 2019 和SPSS 16.0 软件进行处理和分析，用Duncan’s 法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 正交试验设计结果分析

从表3 可以看出，不同培养基配方对愈伤诱导率的影响不同，其中处理8、12 愈伤诱导率最高，均达到100%；其次分别是处理9、10，愈伤诱导率均达93.3%；处理5 的愈伤诱导率最低，为63.3%。结果表明，处理8、9、10、12 与其余处理之间差异显著，而处理1、2、3、4、6、7、14、16 之间无差异显著。

从正交试验结果的直观分析（表4）可以看出，毒莠定浓度（因素A）对愈伤诱导率的影响较大，而KT 浓度（因素B）和6-BA 浓度（因素C）以及IAA 浓度（因素D）对其影响次之。从表4 的极值可确定4 个因素对愈伤诱导率影响程度顺序为：A>B>C＞D；根据表4 中各因素水平均值的大小，可得愈伤组织诱导的最优组合为ABCD， 即毒莠定浓度20 mg/L 、KT 浓度2 mg/L、6-BA 浓度1 mg/L、IAA 浓度0 mg/L。

2.2 不同处理愈伤组织诱导情况

从图1 可以看出，处理9、10、11、12 的愈伤组织表面有一些光滑且球形的愈伤组织，而其余处理中很少看见有这种类型的愈伤组织产生。

2.3 体细胞胚诱导结果分析

从表5 可以看出，处理1、2、3、4、5、6、7、8、13、15 均未诱导出体胚，体胚诱导率均为0。处理10 的体胚诱导率最高，显著高于其余处理，体胚诱导率由高到低依次为处理10＞处理9＞处理11＞处理14＞处理12＞处理16，分别为33.3%、18.3%、16.7%、13.3、11.7%、6.7%。处理11、12、14 之间无显著差异。

從图2 可以看出，处理9、10、11 虽然能长出体胚，但是多为不正常的体胚，仅有处理14 能产生个别正常体胚。

2.4 植株再生情况分析

从体胚发生培养基中挑选出11 个较正常的体胚，转入植株再生培养基中进行再生（图3），其中出苗2 株，7 个只长根不抽芽，2 个既不抽芽也不长根，植株再生率为18%。

3 讨论

在橡胶树中，胚性愈伤组织的获得主要有花药培养和内珠被培养2 种途径。其中，花药培养是橡胶树离体培养中研究最多的一个方向，也是橡胶树生物技术育种的主要途径[14]。经由花药培养获得的易碎胚性愈伤组织可通过继代培养快速增殖，再进行批量的体胚诱导和植株再生[15]，或者进行悬浮培养建立胚性悬浮细胞系，以此作为原生质体培养的最佳分离材料[16]。因此，如何获得良好的胚性愈伤组织对开展后续的研究具有重要的研究意义。

本研究明确了橡胶树花药愈伤组织诱导的最优组合为ABCD，即毒莠定浓度20 mg/L、KT浓度2 mg/L、6-BA 浓度1 mg/L、IAA 浓度0 mg/L。本研究结果表明，对胚性愈伤的诱导起主要作用的是毒莠定浓度，其浓度在20～30 mg/L 之间时，对胚性愈伤组织的诱导有促进作用。低浓度的毒莠定虽然也能诱导愈伤组织产生，但是这些愈伤组织几乎为无胚胎发生能力的非胚性愈伤组织。

在体胚诱导阶段所用培养基为橡胶树热研7-33-97 品种的体胚诱导培养基，产生的多为不正常的体细胞胚，可能是由于体胚发生的基因型依赖所致，今后的研究中也需要针对热垦628 品种研发针对性的体胚诱导培养基。本研究所有处理在诱导愈伤组织25～28 d，愈伤组织达到快速增殖时期，为了更好地确定愈伤组织的生长发育状态，今后要更加关注25 d 以前的愈伤组织状态，在该研究的基础上优化愈伤诱导培养基配方，使其能更快地从花药诱导胚性愈伤，缩短胚性愈伤诱导时间，降低变异发生机率，以及为引进法国RITA培养系统提供更好的起始培养材料。本研究中植株再生率为18%，远低于热研7-33-97 的70%左右，原因可能有以下两方面，一是所使用的体胚还不够成熟，二是所使用的植株再生培养基不适用于橡胶树热垦628 品种植株再生。有1 株移栽于沙床中进行驯化。但由于移栽时工人不慎将叶片弄掉以及后期管理不到位，很遗憾最终没能移栽成活。由于初次诱导的植株较少，且没有移栽成活，所以未对其进行遗传变异检测，但是从植株的叶片形态和株高上看，无明显变异特征。